🤪 Rliger | 完美整合单细胞测序数据（部分交集数据的整合）（三）

生信漫卷

发布于 2023-02-24 13:56:27

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1写在前面

对于只有只有部分重叠的datasets，合并方法我们依然可以采用Seurat、Harmony，rliger包，本期介绍一下rliger包的用法。

2用到的包

rm(list = ls())
library(Seurat)
library(SeuratDisk)
library(SeuratWrappers)
library(patchwork)
library(harmony)
library(rliger)
library(RColorBrewer)
library(tidyverse)
library(reshape2)
library(ggsci)
library(ggstatsplot)

3示例数据

这里我们提供1个3’ PBMC dataset和1个whole blood dataset。🤗

umi_gz <- gzfile("./GSE149938_umi_matrix.csv.gz",'rt')  
umi <- read.csv(umi_gz,check.names = F,quote = "")

matrix_3p    <- Read10X_h5("./3p_pbmc10k_filt.h5",use.names = T)

创建Seurat对象。🧐

srat_wb <- CreateSeuratObject(t(umi),project = "whole_blood")
srat_3p <- CreateSeuratObject(matrix_3p,project = "pbmc10k_3p")
rm(umi_gz)
rm(umi)
rm(matrix_3p)
srat_wb
srat_3p

4修改metadata

为了方便后续分析，这里我们对metadata进行一下注释修改。

colnames(srat_wb@meta.data)[1] <- "cell_type"
srat_wb@meta.data$orig.ident <- "whole_blood"
srat_wb@meta.data$orig.ident <- as.factor(srat_wb@meta.data$orig.ident)
head(srat_wb[[]])

5初步合并

5.1 简单合并

这里我们先用merge将2个数据集简单合并在一起。（这里我们默认做过初步过滤了哈，具体的大家可以看一下之前的教学。）😘

wb_liger <- merge(srat_3p,srat_wb)

5.2 标准操作

我们在这里做一下Normalization，寻找高变基因等等标准操作。👀Note! 这里需要跟大家说下，rlinger在ScaleData时没有将数据中心化,我们需要设置为F。

wb_liger  <- NormalizeData(wb_liger)
wb_liger  <- FindVariableFeatures(wb_liger)
wb_liger  <- ScaleData(wb_liger, split.by = "orig.ident", do.center = F)

5.3 合并数据

wb_liger <- RunOptimizeALS(wb_liger, k = 30, lambda = 5, split.by = "orig.ident")
wb_liger <- RunQuantileNorm(wb_liger, split.by = "orig.ident")

6降维与聚类

6.1 寻找clusters

wb_liger <- FindNeighbors(wb_liger,reduction = "iNMF",k.param = 10,dims = 1:30)
wb_liger    <- FindClusters(wb_liger)

6.2 聚类可视化

wb_liger    <- RunUMAP(wb_liger, dims = 1:ncol(wb_liger[["iNMF"]]), 
                       reduction = "iNMF",verbose = F)

wb_liger <- SetIdent(wb_liger,value = "orig.ident")

p1 <- DimPlot(wb_liger,reduction = "umap") + 
  scale_color_npg()+
  plot_annotation(title = "10k 3' PBMC and 10k 5' PBMC cells, after integration (LIGER)")

p2 <- DimPlot(wb_liger, reduction = "umap", 
              group.by = "orig.ident", pt.size = .1, split.by = 'orig.ident') +
  scale_color_npg()+
  NoLegend()

p1 + p2

wb_liger <- SetIdent(wb_liger,value = "seurat_clusters")

ncluster <- length(unique(wb_liger[[]]$seurat_clusters))

mycol <- colorRampPalette(brewer.pal(8, "Set2"))(ncluster)

DimPlot(wb_liger,reduction = "umap",label = T,
        cols = mycol, repel = T) + 
  NoLegend()

6.3 具体查看及可视化

我们看下各个clusters在两个datasets各有多少细胞。

count_table <- table(wb_liger@meta.data$seurat_clusters, wb_liger@meta.data$orig.ident)
count_table

#### 可视化
count_table %>% 
  as.data.frame() %>% 
  ggbarstats(x = Var2, 
             y = Var1,
             counts = Freq)+
  scale_fill_npg()