关于什么是单细胞测序的知识整理，ChatGPT会做的更好吗？

前些天我们发起了关于ChatGPT在生物信息学领域应用情况的讨论，绝大部分情况下都仅仅是代替我们查各个软件流程的官方文档，或者查各种博客，交流群资料。详见：用ChatGPT做生信？只不过是帮助懒人查官方文档

既然ChatGPT如此擅长查询和整理资料，那么关于什么是单细胞测序的知识整理，ChatGPT会做的更好吗？我先给出来一个学徒的知识整理，借花献佛给大家。然后大家可以自己玩一下ChatGPT，看看能不能做出来如此出色的整理。

近年来，基于 DNA 测序技术基础发展起来的单细胞测序技术已经彻底扩大了基因组学和生物医学研究的规模和范围，本文基于国内外相关文献资料，梳理了单细胞测序的一些概念。

Part1正文

1介绍

1977 年，Sanger 测序问世于研究者们的眼中，这是由 Frederick Sanger 发明的 一种 DNA 测序方法，其原理是利用修饰的双脱氧核苷酸导致 DNA 链的终止。人们终于可以了解自己体内的遗传密码，但是该方法劳动强度大且成本昂贵。所以，耗资超过 30 亿美元的“人类基因组计划”得以启动，在 2003 年基本完成整个人类基因组的测序。之后又开启了二代测序技术以高通量为特征逐渐浮现于人们的视野，Roche 公司的 454 测序平台、还有 Illumina 公司的 Solexa 测序系统等诞生于此时期。虽然各测序系统在技术方法、操作细节、精确度、准确度等方面各有优势，但与第一代测序对比发现它们共同具有速度快、通量高、成本低的特点。如今正在研发热潮的第三代测序是利用通过增加荧光分子在测序时的信号强度等手段，可以让测序流程减掉 PCR 扩增这一环节，从而可以使因为传统方法中 PCR 扩增进行时所带来的可能发生的错误率得以消除，因此第三代测序既拥有高通量测序的优点又同时可以实现更高的精确度和准确性。

而从测序方法应用的对象来看，在传统的测序中，不管是哪种测序技术，其原理都是将多个细胞来源的 DNA、RNA 破碎后混合在一起等当作一个整体样本，即把多个细胞的基因表达的平均值当作这群测序细胞的代表。然而对于多细胞生物来说，细胞与细胞之间已经存在较大的不同，特别是面对某些特定情况，像对来自分布于肿瘤同一部位的多个细胞进行测序分析，传统研究中默认取样的部位是不存在差异的，而其中被忽略的可能存在特异性的细胞信息或许正是我们想要研究和发现的重点。过去受限于技术的发展，更高分辨率的测序难以实现，而单细胞测序技术的诞生则完全使这一现象得到了改变。利用单细胞测序技术，人们可以知道每一个细胞的基因组表达状态或不同细胞内基因的表达，进而分析细胞之间的共性和差别，进一步对时间顺序、空间顺序上的动态变化与对应特征进行探究，相关研究将迈向一个全新的层次和水平。

目前，单细胞测序分为全基因组、转录组和表观基因组测序，应用比较广泛是scRNA-seq。scRNA-seq允许比较单个细胞的转录组。scRNA-seq的一个主要用途是评估细胞群内的转录相似性和差异性，早期的报告揭示了以前未被重视的异质性水平。因此，异质性分析仍然是开展scRNA-seq研究的核心原因。

单细胞测序技术发展图

典型的scRNA-seq工作流程包括以下步骤：①隔离单细胞，②细胞裂解，同时保存mRNA，③信使RNA捕获，④逆转录的互补DNA（cDNA），⑤cDNA扩增，⑥准备cDNA测序库，⑦池序列库，⑧使用生物信息工具来评估质量和可变性，和 ⑨使用专门的工具/方法来分析和呈现数据，如 t-分布的随机邻域嵌入。

scRA测序（scRNA-seq）实验的一般工作流程

目前，常用的扩增方法主要有两类：基于单细胞全基因组扩增（ingle-cell whole-genome amplification，WGA）和单细胞转录组扩增（whole-transcriptome amplification，WTA）。

单细胞测序技术的扩增方法分类

目前已经有多种单细胞测序方法相继出现。总体来看，这些方法可以大致分为两种类型：全长型和基于标签型。这两种方法的主要代表为 SMART-seq2和Drop-seq。

2015 年哈佛团队开发 Drop-seq（droplet-based RNA-seq technology）方法并发表于 Cell 上，文章介绍 Drop-seq 是一种快速分析成千上万个单个细胞的方法，属于微流体装置，将来自组织的细胞群分离成单个细胞，通过带有条形码的微珠和细胞一起装入微小的液滴，条形码随后会连接到反转录后的 cDNA 上，将不同的条形码与每个细胞的转录组联系起来，并对它们进行排序。Drop-seq 可以同时分析数千个单个细胞的 mRNA 转录本，并同时记住转录本的细胞来源。通过 Drop-seq，研究者们可以在短短 12 小时内准备 10000 个单细胞库进行测序，每个细胞的成本大约为 6.5 美分，该技术的出现极大降低了成本同时提升了测序效率。

美国和瑞典的科学家早在 2012 年就共同开发了一种新的单细胞测序技术Smart-seq（switching mechanism at 5’end of the RNA transcript），这同样是一项具有里程碑意义的技术，这种技术与 Drop-seq 对比其优点是能够检测 mRNA 的全长。在转录本的序列覆盖度上有所改善。但同时也存在缺点，即具有转录本长度偏向性，不具有链特异，不能高效转录超过 4 Kb 的序列。所以 2013 年，Nat Methods上有一篇文章又将 Smart-seq 技术做了一些改进，新的技术称为 Smart-seq2，在新技术中锁核酸、更高浓度的 MgCl2以及甜菜碱被研究者使用。Smart-seq2 不再需要纯化步骤，产量得到了极大的提高，但其只能扩增和检测到具有 poly(A) 尾巴的mRNA。通过反转录、模板转换和预扩增的改进使单个细胞产生的 cDNA 文库的产量和长度得以增加。与 Smart-seq 文库相比，Smart-seq2 转录组文库对检测、覆盖、偏倚和准确性进行了改进，而且能使用现成的试剂以较低的成本生成。优化了过去单细胞转录测序技术的覆盖率、敏感度及通量。

单细胞转录组测序原理、方法及特点

在完成人类基因组计划后，科学家们提出了一个人类细胞图谱计划，旨在完成人体中37万亿个细胞的测绘。目前，人类细胞图谱已经生成了所有人类细胞的全面分子图谱：

https://data.humancellatlas.org/

2上游分析/数据预处理

上游分析对应着下图的数据预处理部分，就像一条河的上下两端，上游水质受污染，必然影响着下游水质。

一个典型的scRNA序列分析工作流程的示意图

数据库

单细胞测序数据相关的数据库有：

1. GEO https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/
2. HCA https://data.humancellatlas.org/
3. Single Cell Portal https://singlecell.broadinstitute.org/single_cell/

还有很多数据库，参考：https://zhuanlan.zhihu.com/p/456407197。也可以自行检索 https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/?term=scrna+seq+database&size=50，一般有课题组建立了数据库都会发表相应的文章，同时也可以参考其他人在使用哪些数据库。

质量控制

细胞质量控制(QC)通常基于三个QC协变量来执行：每个条形码的计数数量（计数深度），每个条形码的基因数量，以及每个条形码的线粒体基因计数的比例。

来自Haber等人（2017）的小鼠肠道上皮细胞数据集的带有过滤决策的质量控制指标图

目前已有一些作者开发出相应的工具来快速完成数据的预处理及分析，如Seurat(R包)(https://satijalab.org/seurat/articles/pbmc3k_tutorial.html)中scRNA-seq数据的标准预处理工作流程中的QC：

# The [[ operator can add columns to object metadata. This is a great place to stash QC stats
pbmc[["percent.mt"]] <- PercentageFeatureSet(pbmc, pattern = "^MT-")

# Visualize QC metrics as a violin plot
VlnPlot(pbmc, features = c("nFeature_RNA", "nCount_RNA", "percent.mt"), ncol = 3)

# FeatureScatter is typically used to visualize feature-feature relationships, but can be used
# for anything calculated by the object, i.e. columns in object metadata, PC scores etc.

plot1 <- FeatureScatter(pbmc, feature1 = "nCount_RNA", feature2 = "percent.mt")
plot2 <- FeatureScatter(pbmc, feature1 = "nCount_RNA", feature2 = "nFeature_RNA")
plot1 + plot2

pbmc <- subset(pbmc, subset = nFeature_RNA > 200 & nFeature_RNA < 2500 & percent.mt < 5)

标准化/归一化

Counts矩阵中的每个count代表成功捕获、逆转录和测序一个细胞mRNA分子。由于这些步骤中固有的可变性，相同单元格的计数深度可能会有所不同。因此，当基于计数数据比较细胞间的基因表达时，任何差异都可能仅仅是由于抽样效应而产生的。归一化解决了这个问题，例如通过缩放计数数据，以获得细胞之间正确的相对基因表达丰度。

Seurat中提供了三种标准化数据的方法：

1. LogNormalize: 每个单元格的特征计数除以该单元格的总计数，再乘以scale.factor。然后使用log1p对自然对数进行转换。
2. CLR: 应用一个以中心为中心的对数比转换。
3. RC: 相对计数。每个单元格的特征计数除以该单元格的总计数，再乘以scale.factor。不应用对数转换。对于每百万计数（CPM）设置的scale.factor= 1e6。

如：

pbmc <- NormalizeData(pbmc, normalization.method = "LogNormalize", scale.factor = 10000)

数据校正与整合

标准化的数据可能仍然包含不必要的可变性。数据校正针对进一步的技术和生物协变量，如批处理、辍学或细胞周期效应。这些协变量并不总是被修正。决定考虑哪些协变量将取决于预期的下游分析。我们可以分别考虑生物和技术协变量的校正，因为它们用于不同的目的，并提出独特的挑战。

生物协变量的校正

最常见的生物学数据修正是消除细胞周期对转录组的影响，可以通过对在Scanpy(python包)https://scanpy.readthedocs.io/en/stable/tutorials.html 和Seurat平台中实现的细胞周期评分的简单线性回归来执行。

也可以使用具有更复杂的混合模型，如scLVM https://github.com/PMBio/scLVM。

技术协变量的校正

单细胞数据中最突出的技术协变量是计数深度和批次处理。用于回归生物协变量的回归模型的变量也可以应用于技术协变量。当校正多个协变量（例如细胞周期和计数深度）时，应该在一个步骤中对所有协变量进行回归，以解释协变量之间的依赖性。

另一种替代基于回归的消除计数影响的策略是使用更严格的归一化程序，如降采样或非线性归一化方法。

这些方法可能特别适用于基于平板的scRNA-seq数据集，在这些数据集中，每个细胞的计数深度的较大变化可以掩盖细胞之间的异质性。

批次效应和数据整合

当细胞在不同的组中处理时，可能会产生批次效应。在同一实验中，纠正样品或细胞之间的批次效应是一种经典的场景，即来自bulk RNA-seq的批次校正。

将来自多个实验的数据整合在一起，则称之为数据整合。虽然批次效应通常使用线性方法进行校正，但非线性方法被用于数据整合。

单细胞转录组数据整合方法的概览

单细胞数据整合分为多源 scRNA-seq 数据整合和多模态数据整合，前者侧重某一组织内细胞类型的完整性，后者更侧重调控机制的挖掘。

单细胞数据整合的图解概述

另一种技术类型的数据校正是Expression recovery（也包括去噪或插补）。值得注意的是，用户应该谨慎对待只有在Expression recovery后才会发现的信号。探索性分析最好不需要这一步。

特征选择、降维和可视化

一个人类单细胞RNA-seq数据集可以包含多达25,000个基因的表达值。这些基因中的许多将不会为给定的scRNA-seq数据集提供信息，而且许多基因将大多包含零计数。即使在QC步骤中过滤掉这些零计数基因后，一个单细胞数据集的特征空间也可以有超过15,000个维度。为了减轻下游分析工具的计算负担，减少数据中的噪声，并将数据可视化，可以使用几种方法来降低数据集的维数。

特征选择

降低scRNA-seq数据集维的第一步通常是特征选择。在这一步中，数据集被过滤，只保留数据中可变性“信息”的基因。因此，经常使用高度可变的基因（HVGs）。

seurat中特征选择的代码及例图如下：

pbmc <- FindVariableFeatures(pbmc, selection.method = "vst", nfeatures = 2000)

# Identify the 10 most highly variable genes
top10 <- head(VariableFeatures(pbmc), 10)

# plot variable features with and without labels
plot1 <- VariableFeaturePlot(pbmc)
plot2 <- LabelPoints(plot = plot1, points = top10, repel = TRUE)
plot1 + plot2

降维

细胞表达谱所在的生物流形(biological manifold)可以用比基因数量少得多的维度来充分描述。降维旨在找到这些维度。

常用的降维方法有PCA，t-SNE，UMAP。

参考：https://cloud.tencent.com/developer/article/1674812

可视化

为了可视化的目的，使用非线性降维方法是标准的做法。

数据处理的阶段和适当的下游分析应用

推荐UMAP用于探索性可视化；PCA用于一般性的总结；扩散映射作为轨迹推理概括的PCA的替代方法。使用UMAP的PAGA是可视化特别复杂的数据集的一个合适的替代方案。

3下游分析

下游分析的方法被用于探索生物学的线索和描述潜在的生物系统。

下游分析方法概述

细胞水平分析

细胞水平的分析通常集中于两种结构的描述：聚类和轨迹。这些结构又可以在细胞和基因水平上进行分析，从而形成了聚类分析和轨迹分析两种不同的方法。

聚类分析

将细胞聚集成簇通常是任何单细胞分析的第一个中间结果。聚类可以使我们推断出成员细胞的身份。

表中显示了应用于scRNA-seq数据聚类的聚类算法的主要类别

推荐在单细胞KNN图上通过鲁汶社区检测(Louvain community detection)进行聚类。该方法是在Scanpy和Seurat单细胞分析平台上实现的默认聚类方法。

聚类注释

在基因水平上，通过寻找每个聚类的基因特征，对聚类数据进行分析。这些所谓的标记基因表征了集群的特征，并被用有意义的生物标签进行注释。这个标签表示集群内细胞的身份。由于任何聚类算法都会产生数据的分区，因此所识别的聚类的有效性只能通过对所表示的生物学的成功注释来确定。

目前常用的注释方法有人工注释和自动注释(如：singleR https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/SingleR.html)。如果存在相关的参考图集，建议使用自动聚类注释与基于数据衍生的标记基因的人工注释相结合来注释聚类。

成分分析

在细胞层面上，我们可以根据其组成结构来分析其聚集数据。成分分析围绕着每个细胞身份集群的细胞比例。这些比例可能会随着疾病的变化而发生变化。

注意，对样本之间细胞实体簇比例变化的统计检验是相互依赖的。

轨迹分析

轨迹推理

细胞多样性不能用聚类等离散的分类系统来充分描述。驱动所观察到的异质性发展的生物过程是连续的过程。因此，为了捕捉细胞身份、分支分化过程或生物学功能的逐渐、不同步的变化，我们需要基因表达的动态模型。这类方法被称为轨迹推理(trajectory inference, TI)。

推断出的轨迹不一定代表生物过程。很少有TI方法包括在其模型中评估不确定性。因此，需要进一步的信息来验证一个生物过程是否确实被捕获了。这些信息可以以扰动实验的形式出现，推断调控基因变化，和来自RNA速率(RNA Velocity)的支持。

基因表达变化

一种支持所推断的轨迹不是拟合转录噪声的结果的方法是在基因水平上分析轨迹。在拟时序中平稳变化的基因描述了轨迹，并可用于识别潜在的生物过程。此外，这组与轨迹相关的基因预计将包含调节模型过程的基因。调节基因帮助我们理解生物过程是如何以及为什么被触发的，并代表潜在的药物靶点。

目前，专门用于基因时间动态变化的工具还很少。BEAM是一个集成到Monocle TI管道中的工具。鉴于可用的工具很少，目前还不能确定研究基因时间动态变化的最佳实践。

亚稳态状态

细胞水平的轨迹分析研究了跨拟时序的细胞密度。假设细胞以一种无偏倚的方式取样，沿着轨迹的密集区域表明首选的转录组状态。当将轨迹解释为一个时间过程时，这些密集的区域可能代表亚稳态。我们可以通过绘制伪时间坐标的直方图来找到这些亚稳态。

PAGA

the partition-based graph abstraction tool (PAGA), 这是唯一回顾的能够处理互不连接的拓扑和包含循环的复杂图的方法。这个特性使PAGA成为一个可视化整个数据集拓扑结构的有用工具，也可以用于探索性分析。

基因水平分析

单细胞数据的基因水平分析有比表征细胞结构的基因水平分析更广泛的范围。差异表达检验、基因集分析和基因调控网络推断直接研究数据中的分子信号。这些方法不是描述细胞的异质性，而是利用这种异质性作为理解基因表达的背景。

差异表达检验

与bulk差异检验相比，其单细胞差异检验一个优势是，我们可以通过在细胞身份集群内进行差异检验来解释单细胞数据集中的细胞异质性。我们可以从这一方法中得知，在特定的实验条件下，细胞的身份是如何发生转录反应的。

在多物种转录组学分析的情况下，通常对每个生物体进行单独的差异表达分析。常用的R包有 DESeq2 (https://www.bioconductor.org/packages/devel/bioc/vignettes/DESeq2/inst/doc/DESeq2.html) 和 edgeR (https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html)，它们都使用原始读取计数而不是归一化计数来执行差异表达分析。

不过也有学者认为在大样本量RNA-seq差异分析时，应使用Wilcoxon秩和检验：https://www.plob.org/article/27145.html。

还有两种比较好的方法：MAST，limma。它们也有对应的R包。

基因集分析

基因水平的分析方法通常会产生一长串难以解释的候选基因。例如，数千个基因在处理细胞和对照细胞之间可能有差异表达。我们可以通过根据共有特征将基因分组，并测试这些特征是否在候选基因列表中过多，来促进这些结果的解释。

基因集信息可以在各种应用程序的策划标签数据库中找到。为了解释DE的结果，我们通常根据参与共同的生物过程对基因进行分组。生物过程标签存储在MSigDB、Gene Ontology，或通路数据库 KEGG 和 Reactome 等数据库中。

单细胞分析领域的最新发展是使用配对基因标签进行配体-受体分析。也就是细胞间通讯 CellPhoneDB (https://github.com/Teichlab/cellphonedb)。

基因调控网络

基因并不是独立运作的。相反，一个基因的表达水平是由与其他基因和小分子的调节相互作用的复杂相互作用决定的。基因调控网络（GRN）推理方法的目标就是揭示这些调控相互作用。

基因调控网络推断是基于基因共表达的测量，如相关性、互信息(mutual information)，或通过回归模型进行的。如果两个基因显示出共表达信号，即使所有其他基因都被考虑为潜在的混杂因素，这些基因也被认为有因果调节关系。推断基因调控关系与轨迹相关调控基因的检测有关。事实上，一些单细胞GRN推理方法使用轨迹与机械微分方程模型。

但是目前， scRNA-seq 数据的基因调控网络方法并不多，而且效果也不是很理想，应警惕所推断出的调控关系中的不确定性。

补充

大家也可以尝试着进行下图的下游分析方法：

典型多物种RNA-Seq分析的下游分析示例的一般工作流程。使用BioRender.com创建

4分析平台

单细胞分析工作流是对独立开发的工具的整理。为了促进数据在这些工具之间的运行，学者们已经围绕一致的数据格式开发了单细胞平台。目前使用的比较多的有R、Python以及网页工具。

在R平台中，Scacter和Seurat可以很容易地与 R Bioconductor project 提供的各种分析工具进行接口。Scacter在QC和预处理方面具有特殊的优势，而Seurat可以说是最受欢迎和最全面的平台，其中包括大量的工具和教程。

在Python平台中， scanpy 是一个不错的选择。用Python编写的工具在机器学习应用程序中特别流行。

5展望

未来的单细胞平台将必须能够处理不同的数据来源，如DNA甲基化、染色质可及性或蛋白质丰度，并包括整合这些模式的工具。

scRNA-seq也将从专业研究实验室发展出来，并将成为基础科学家和临床医生的既定工具。

Part2写在文末

非常推荐认真阅读参考资料中的2(实例)、6(理论)和Seurat官方教程(实战)，然后有看不懂的地方可以去生信技能树,单细胞天地,生信菜鸟团等微信公众号上找一找有没有相关的推文。

我整理了一些单细胞相关资料，里面包含了一些曾老师之前分享过的资料，在《繁尘的bio小本本 》公众号 后台回复20230213获取。

还有一句话想和大家分享：“想的多了都是问题，做的多了都是答案。”先想后做，然后不要害怕犯错，勇敢地去做。

参考资料

1. 生信技能树团队分享的资料
2. 李天欣. 基于单细胞测序的急性髓系白血病免疫细胞异质性研究[D].哈尔滨工业大学,2020.DOI:10.27061/d.cnki.ghgdu.2020.000008.
3. Haque A, Engel J, Teichmann SA, Lönnberg T. A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications. Genome Med. 2017 Aug 18;9(1):75. doi: 10.1186/s13073-017-0467-4. PMID: 28821273; PMCID: PMC5561556.
4. 胡月,赵卓.单细胞转录组测序及其在心血管疾病中的应用进展[J/OL].实用心脑肺血管病杂志:1-7[2023-02-08].http://kns.cnki.net/kcms/detail/13.1258.R.20230112.1925.011.html
5. 张永卓,傅博强,牛春艳,高运华,王晶.单细胞测序技术的发展[J/OL].计量学报,2023(01):149-156[2023-02-08].http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1864.TB.20230117.1119.002.html
6. Luecken MD, Theis FJ. Current best practices in single-cell RNA-seq analysis: a tutorial. Mol Syst Biol. 2019 Jun 19;15(6):e8746. doi: 10.15252/msb.20188746. PMID: 31217225; PMCID: PMC6582955.
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8. Petegrosso R, Li Z, Kuang R. Machine learning and statistical methods for clustering single-cell RNA-sequencing data. Brief Bioinform. 2020 Jul 15;21(4):1209-1223. doi: 10.1093/bib/bbz063. PMID: 31243426.
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