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细胞活力检测方法大盘点,CTG 法放大招?- MedChemExpress

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MedChemExpress
发布2023-03-29 13:16:43
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文章被收录于专栏:生命科学生命科学

细胞活力检测产品大 PK

常用的细胞活力检测试剂主要有 MTT、CCK8 等检测方法 (图 1)。

MTT法:又称 MTT 比色法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性 MTT 还原为不溶于水的蓝紫色结晶甲臜 (Formazan) 并沉积在细胞中,但死细胞无此功能,后经 DMSO 溶解,于 490 nm 处测定吸光值便可间接反应细胞活力。但该方法除去操作步骤耗时以外,生成的 Formazan 是不溶于水的,需经 DMSO 溶解后才能检测,增加了工作量的同时仍不能保证测定结果的准确性,且该溶剂对人体具有明显毒性。

CCK8:相较于 MTT,无论是操作步骤还是检测时间都优化了很多。CCK8 是一种基于 WST-8 而广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速、高灵敏度、无放射性的比色检测方法(可看往期推文 CCK-8,让细胞活性检测 So Easy!)。但在实验时,一直有个问题让人很困扰——“细胞增殖越多越快,则颜色越深;细胞毒性越大,则颜色越浅”,但这个颜色深浅的标准我 “标” 不出来怎么办?痛点!痛点!痛点!

科研汪 :MTT 作为“元老”级别的检测方法,虽然“老练”,Paper 无数,但麻烦是真麻烦,CCK8 法倒是便捷很多!

小 M:那你是还没用过更便捷的...

科研汪 :莫非你说的是细胞活力检测的“金标准”?

小 M:CTG 细胞活力检测,简单、灵敏、快速的均质检测方法,反应 10 分钟即可得到“Bling Bling”的检测结果,你就说“快不快”?

CTG 发光法:基于高灵敏度生物发光检测技术,通过对三磷酸腺苷 (ATP) 进行定量以测定培养物中活细胞数目及细胞活力。该实验方法可用三个字简单概括 “快、准、狠”,比 MTT 的处理速度快近 20 倍,节省时间近 4 小时。CTG 特有的均质检测法“加样-混样-检测”,使用时,只需将本试剂等体积添加至培养细胞中即可进行检测。不用感慨,细胞活力检测为什么不能如此简单?

图 1. MTT、CCK8 与 CTG 法的实验流程图

表 1. MTT、CCK8 与 CTG 法特点比较

CTG,适用于哪些实验

首先,来了解实验 CTG 发光法的测定原理:ATP 作为细胞新陈代谢的一个重要指标,与活细胞数目呈良好的线性关系,是细胞活力检测的重要标志性分子。

ATP 生物发光的原理为:荧光素酶以荧光素、ATP 和 O2 为底物,在 Mg2+ 存在时,可将化学能转化为光能;在荧光素酶催化的发光反应中,ATP 在一定的浓度范围内,其浓度与发光强度呈线性关系,即在光信号与酶反应体系中,发光值与 ATP 呈正比,ATP 与活细胞数成正比,CTG 发光法通过 ATP 含量来进行细胞计数或活力测定,且不受化合物自发荧光的影响 (图 2),是细胞增殖测定,细胞活力测定和细胞毒性高通量筛选分析的理想选择。

图 2. CTG 法检测原理

■ 案例 1:细胞增殖测定

如图 3 所示,为了探究 SIPL1 对 TNBC 细胞增殖的影响,将 SIPL1 表达载体转染至 BT-549 与 MDA-MB-231 细胞, 并使用 CCK8 法与 CTG 法,进行细胞增殖检测。

CCK-8 检测:TNBC 细胞瞬时转染 shRNA 或过表达质粒并培养 24 h 后检测。

CTG 发光细胞活力测定:TNBC 细胞在 37°C 下培养过夜。然后,将 100 µL CTG 溶液直接与培养基混合,在室温下培养 20 分钟。结果显示,转染靶向 SIPL1 shRNAs 的 BT-549 和 MDA-MB-231 细胞系的细胞增殖显著降低 (图 3)。

图 3. SIPL1 对 TNBC 细胞活力的影响[1] CCK-8 (a) 和 CTG 发光细胞活力测定 (b) 用指示载体转导 BT-549 和 MDA-MB-231 细胞增殖能力的分析。
图 3. SIPL1 对 TNBC 细胞活力的影响[1] CCK-8 (a) 和 CTG 发光细胞活力测定 (b) 用指示载体转导 BT-549 和 MDA-MB-231 细胞增殖能力的分析。

■ 案例 2:细胞活力测定

如图 4 所示,为了探究外源 RRM2 是否会影响肝癌细胞的铁死亡,在 HepG2 和 SMMC-7721 细胞中过表达或敲除 RRM2,通过 CTG 法检测其对细胞活力的影响。结果表明,过表达 RRM2 时,细胞活力明显增强,反之,敲除 RRM2 时,细胞活力明显降低[1]。

图 4. 通过 CTG 法测定 RRM2 对细胞活力的影响[2] (a) 在体外表达或敲除 RRM2 的 HepG2 和 SMMC-7721 细胞中测量细胞死亡 (b) 和 4-HNE 水平 (c),然后再用 Fer-1、ZVAD-FMK、Nec-1 或体外表达的 RRM2 进行进一步处理。细胞活力测定采用 CTG 发光细胞活力测定法。
图 4. 通过 CTG 法测定 RRM2 对细胞活力的影响[2] (a) 在体外表达或敲除 RRM2 的 HepG2 和 SMMC-7721 细胞中测量细胞死亡 (b) 和 4-HNE 水平 (c),然后再用 Fer-1、ZVAD-FMK、Nec-1 或体外表达的 RRM2 进行进一步处理。细胞活力测定采用 CTG 发光细胞活力测定法。

■ 案例 3:细胞毒性高通量筛选分析

如下图所示,作者团队报告了一种基于浓度-反应曲线的表型定量高通量筛选 (qHTS),旨在识别对疟原虫肝脏和无性血期寄生虫具有活性的化合物 (图 5)。使用 SYBR Green 或荧光素酶来测试对寄生虫生长的抑制,共检测了 456,817 种化合物。

在 qHTS 之后,又分类选择了 4,253 种合成易处理的化合物,用于验证抗疟原虫活性和哺乳动物毒性。在 3 μM 和 1 μM 浓度下对化合物进行体外抗伯氏疟原虫肝期寄生虫的评估。其中使用 CTG 法评估了所有 4,253 种化合物对 HepG2 的细胞毒性。其中 255 种化合物对 HepG2 细胞表现出一定程度的生长细胞毒性,AC50 值 < 43 µM (随后被排除)。最终筛选出 994 种经过验证的无毒性化合物,用于针对肝阶段寄生虫的后续评估。

图 5. 针对恶性疟原虫无性血期寄生虫的定量高通量筛选[3]。
图 5. 针对恶性疟原虫无性血期寄生虫的定量高通量筛选[3]。

CTG “得宠” 理由汇总

图 6. MCE CTG Cell Viability Detection Reagent 与同类产品(竞品)对比测试结果  a. 产品发光稳定性测试(293T 细胞);b. 不同细胞数的线性范围比较 (293T 细胞);c. 不同细胞系的检测结果比较 (293T、H4IIE、Jurkat 细胞)
图 6. MCE CTG Cell Viability Detection Reagent 与同类产品(竞品)对比测试结果 a. 产品发光稳定性测试(293T 细胞);b. 不同细胞数的线性范围比较 (293T 细胞);c. 不同细胞系的检测结果比较 (293T、H4IIE、Jurkat 细胞)

对比测试结果表明:持续 3 h 的生物发光稳定性的检测中,MCE CTG Cell Viability Detection Reagent 的发光信号值比较稳定 (图 5a);不同细胞数的线性范围中,MCE 产品线性关系良好,与进口 竞品线性几乎一致 (图 5b);且对于不同细胞系,MCE 产品与进口竞品检测信号值相当 (图 5c)。综上检测结果表明,MCE CTG 试剂盒可实现稳定、灵敏、批次间差异较小的不同细胞系的细胞活力检测。

表 2. MCE CTG Cell Viability Detection Reagent 产品特性

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实验小 Tips,附上 CTG 使用注意事项,希望你能早日发 SCI 啦。

1. 荧光素酶的活性对温度较为敏感,反复冻融会致其逐渐失活,建议分装冻存,避免反复冻融。冻融时,可能会导致试剂中出现少量沉淀,可平衡至室温后观测沉淀溶解情况,如仍有残留,可离心后去除。

2. 本产品在使用或分装时所使用耗材应注意避免 ATP 污染。

3. 若待测药物的溶剂含量较高,荧光素酶反应可能会被干扰,致化学发光信号受到影响,可设置含有溶剂的细胞培养液的对照孔以排除此干扰。

4. 检测时需使用适合于细胞培养的白色或黑色的多孔板 (96 孔板或 384 孔板),普通透明多孔板的相邻孔之间可能会产生相互干扰。如使用透明板,可使用不透明的白色胶带粘贴孔底。

5. 建议在避光环境下进行荧光检测。

6. 由于整个发光反应非常迅速,建议加入 CTG 试剂孵育 10 分钟后,立即检测荧光。

相关产品

Cell Counting Kit-8 Cell Counting Kit-8,简称 CCK-8 试剂盒或 CCK8 试剂盒,是一种基于 WST-8 而广泛应用于细胞活性和细胞毒性检测的快速、高灵敏度试剂盒。

CTG Cell Viability Detection Reagent MCE CTG 发光法细胞活力检测试剂盒基于高灵敏度生物发光检测技术,通过对 ATP 进行定量以测定培养物中活细胞数目及细胞活力。

Cytotoxicity LDH Assay Kit MCE LDH Assay Kit 是通过分析释放到培养上清液中的 LDH 活性而测定细胞损伤的试剂盒。配合使用 CCK-8 (Cat.: No. HY-K0301) 可获得死细胞、活细胞数据。

MCE 的所有产品仅用作科学研究或药证申报,我们不为任何个人用途提供产品和服务

参考文献

1. Juanjuan He, Jing Wang, et al. SIPL1, Regulated by MAZ, Promotes Tumor Progression and Predicts Poor Survival in Human Triple-Negative Breast Cancer. Front Oncol. 2021 Dec 17;11:766790.

2. Yueyue Yang, Jiafei Lin, Susu Guo, et al. RRM2 protects against ferroptosis and is a tumor biomarker for liver cancer. Cancer Cell Int. 2020 Dec 7;20(1):587.

3. Dorjbal Dorjsuren, Richard T Eastman, et al. Chemoprotective antimalarials identified through quantitative high-throughput screening of Plasmodium blood and liver stage parasites.Sci Rep. 2021 Jan 22;11(1):2121.

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原创声明:本文系作者授权腾讯云开发者社区发表,未经许可,不得转载。

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