榕树集-蛋白质表面指纹（MaSIF）

前言 蛋白质表面指纹的文章最初是发表在2019年，随后被引用了300多次。

最近又看到了一篇关于其在蛋白质从头设计方面的文章，所以觉得可以尝试写一下。

简介：

分子指纹是一个常见的概念，最初常见于药物设计，用于寻找药物结构相似性。

这里以MASSC指纹进行简要描述：

MACCS (Molecular ACCess System) 分子指纹是一种用于表示分子结构信息的二进制指纹。MACCS分子指纹是基于分子中是否含有特定的亚结构来定义的，共包含166个不同的分子特征。每个特征都对应于一个特定的化学子结构，例如，一个羟基、一个苯环或一个氮原子等。如果分子中存在这个特征，则该特征对应的二进制位上的值为1，否则为0。MACCS分子指纹的长度为166位，它可以用于分子相似性比较、分子分类、分子聚类、分子筛选等许多领域中的化学信息学研究。

分子指纹考虑了结构特征，但是这些结构无序，并么有空间上的相对位置信息，其最后多用谷本系数计算相似性。

而蛋白表面指纹同样考虑到了物化属性和空间属性两个概念，以下会进行详细阐述。

蛋白表面相互作用指纹

蛋白表面相互作用指纹（MaSIF，molecular surface interaction fingerprinting），整体计算框架如下图所示。

其主要采用了蛋白质中的MESH网格表示方法，如下图中的MESH

MESH指的是分子表面的网格化表示，通常是一个离散化的三维网格。在MESH中，分子表面被表示为由许多小三角形组成的网格结构（当然也可由其余多边形组成）。每个三角形的顶点是分子表面上的一个点，这些点可以被分配一些特征，例如几何特征和化学特征。MESH通常用于描述分子表面的形态和特征，以及分子与其他分子之间的相互作用。

MaSIF 计算流程

开源软件，可以直接上Github：https://github.com/LPDI-EPFL/masif，最简单的方法给出了Docker运行，这里不再赘述使用方法和操作流程。

1. 蛋白质表面的计算 对数据集中的所有蛋白质进行质子化处理，并使用密度为3.0和水探针半径为1.5Å的MSMS程序进行三角化处理（也就是形成初步MESH）。然后使用pymesh将蛋白质网格下采样和规则化到1.0Å的分辨率（优化MESH）。在蛋白质网格上直接计算几何和化学特征。
2. 挑选出PATCH 对于蛋白质表面MESH中的每个点，提取了一个以半径为9或12 Å的补丁（PATCH）来分析补丁表面的特征。半径的选择是基于经验的，主要受性能和内存限制的影响。对于MaSIF-search，选择了12 Å，可以覆盖许多PPI的埋藏表面积，同样应用于MaSIF-ligand。选择了9 Å的用于MaSIF-site，因为较小的补丁允许在可用内存资源内进行多个卷积层。
3. 特征计算
   1. 形状指数（Shape index） 形状指数（shape index）是针对表面上每个点的局部曲率而描述的形状，值的范围为−1（高度凹陷）到+1（高度凸起）。它是相对于主曲率κ1,κ2定义的，其中κ1≥κ2，公式为： ‍

   

   1. 距离相关曲率(Distance-dependent curvature) 对于在PATCH中的每个顶点，距离相关曲率计算一个值，在范围[−0.7，0.7]内，描述了每个点到中心点的距离和表面法线之间的关系。
   2. 泊松-玻尔兹曼连续静电表面（Poisson–Boltzmann continuum electrostatics） APBS5(v.1.5) 被用于为每个蛋白质计算泊松-玻尔兹曼静电表面。使用 APBS53 套件中的 Multivalue 将网格表面的每个顶点的电荷值分配。电荷值在+30和-30之间时，并后续将值规范化在-1到1之间。
   3. 自由电子和质子供体（Free electrons and proton donors） 使用氢键势能作为参考，计算分子表面上的自由电子和潜在氢键供体的位置。这些值的范围为-1（氢键受体的最佳位置）到+1（氢键供体的最佳位置）
   4. 疏水性（Hydropathy） 根为每个顶点分配了一个疏水性定值，该定植是基于距离最近的原子的氨基酸种类来计算的。这些原始值在-4.5（亲水性）到+4.5（最疏水性）之间，并被规范化为在-1和1之间。
4. 计算测地极坐标 （geodesic polar coordinates） 提取出的PATCH表面，MaSIF使用测地极坐标系统将顶点的位置映射到径向坐标（即距离中心的测地距离）和角坐标（即与随机方向的角度)相对于该片段的中。这些坐标添加关于特征之间空间关系的信息。

1. 径向坐标 描述点到 patch 中心的测地距离，在MaSIF中，距离是连接表面网格图上节点的边长之和。
2. 角坐标 将PATCH展平到平面上，由于PATCH没有基准方向，因此在计算平面中的随机方向作为参考，并将每个顶点相对于该参考的角度设置为角坐标

1. 几何深度学习（Geometric deep learning） 几何深度学习可以将基于图像的深度神经网络架构，例如卷积神经网络（CNNs），应用于如表面之类的几何数据。在图像分析中使用的传统CNNs可以被认为是在图像上运行滑动窗口；在窗口的每个位置，都会提取一个像素块。然后，每个像素乘以相应的可学习滤波器值并将结果求和。在蛋白质分子表面上，并没有没有规则的网格，因此MaSIF用在本地测地极坐标系中定义的一组高斯核代替它，这些核充当“软像素”，称之为learned soft polar grid。

‍

• f：特征向量
• x ：patch
• J: 每个网格单元

MaSIF 应用范围

• MaSIF-ligand： 配体结合位点预测以及分类
• MaSIF-site：蛋白质相互作用位点预测
• MaSIF-search：基于表面指纹的PPIs预测

基于MaSIF的头蛋白质相互作用从头设计

实际上，从原理来看MaSIF更多的类似于一个分类器，自己没有生成的功能，应该是借助了其余工具。

设计策略

如图1：

在之前的工作中，MaSIF-site将蛋白质分解为PATCH作为输入，并在每个表面点上输出一个对于该点成为PPI内 buried site 倾向性的回归分数。MaSIF-search工具，用于评估蛋白质结合的表面互补性。

为了解决的PPI从头设计问题，作者设计了一个三阶段的计算方法，如上图所示：

• （1）使用MaSIF-site预测具有高结合倾向的目标 buried interface sites（图1a）；
• （2）基于表面指纹搜索具有必要特征的 complementary structural motifs（binding seeds）来engage目标位点（MaSIF-seed）；
• （3）使用已建立的移植技术将binding seed移植到蛋白质支架上，以赋予设计界面的稳定性和额外的接触（图1c）。

MaSIF seed

MaSIF-seed用于鉴定有效结合的相互作用的结合种子的问题。这一任务在蛋白质设计中是一个相当大的挑战，因为需要探索的结构可能性非常多，同时需要高精度，因为微小的原子级变化 - 例如放错的甲基基团，界面中未协调的水分子或不兼容的电荷 都足以破坏PPI。

在MaSIF-seed中，蛋白质分子表面被分解成具有12 Å半径的PATCH，平均捕获近蛋白质上400 Å2的表面积，与本地界面中观察到的埋藏表面积一致（补充图1）。对于补丁内的每个点，计算化学和几何特征，以及本地测地极坐标系。然后训练神经网络以输出向量指纹描述符，这些描述符在相互作用蛋白质对的补丁之间是互补的，并且在非相互作用的蛋白质对之间是不相似的。匹配的表面PATCH与目标位点对齐，并使用第二个神经网络进行评分，输出界面对齐（IPA）得分，以进一步提高区分性能。

简而言之，用Seed捞出哪些与相互作用位点有互补特征的Patch，随后再从蛋白质片段数据库中捞出含有这些Patch特征的片段。

测试效果

作者构建了一个测试集进行基准测试，其中包括114个二聚体复合物，其中31个复合物的binding motif是单个α螺旋段，83个复合物的binding motif由少于50%的螺旋段组成。Decoy sets中，作者使用了1,000个基序（范围从600,000到700,000个Patchs），在螺旋集中，这些基序还具有螺旋二级结构，并且在非螺旋集中，由二和三股β-片构成。

将MaSIF-seed与其他对接方法进行基准测试，以在1,000个decoys中识别正确定向（界面均方根偏差（iRMSD）<3Å）的共结晶结构中的真正结合物。

MaSIF-seed在螺旋集和非螺旋集中分别在18个和41个case中将正确的binding motif识别为得分最高的结果。相比之下，最佳表现的方法ZDock+ZRank2 仅在螺旋集中将6个case识别为得分最高的结果，在非螺旋集中将21个case识别为得分最高的结果。

除了表现更好外，MaSIF-seed的速度也更快，速度增加了20倍到200倍之间，这主要取决于从每个基序中提取的贴片数量。

实例

文中举了三例，这里仅以第一例进行介绍

靶向SASR-CoV-2 RBD

步骤：

1. MaSIF-site预测RBD上的表面位点（这些位点具有被蛋白质binder 所结合的高倾向性）
2. 选择了一个与ACE2结合区域不同但有重叠的位点，以便一个假定的binder可以抑制ACE2-RBD相互作用
3. 搜索了一个包含1.4亿个来自螺旋片段的表面指纹的子集，以找到可以定位到所选位点的bindind seed。MaSIF-seed提供了7,713个bindind seed，其中有两个显著特征：

• 接触表面不含有具有强结合热点特征的残基（如大的疏水残基）
• 结合种子在螺旋片段的两个不同方向上具有等效分布，其结合在彼此相距180°的位置

1. 合成了一个排名靠前的bindind seed的线性肽，但是使用表面等离子共振（SPR）没有检测到任何结合相互作用
2. 使用Rosetta MotifGraft ，确定了几个与种子的两种结合模式兼容的蛋白质支架，将来自排名靠前的种子的热点侧链移植到这些支架上，并使用Rosetta（v.3.13）优化了结合表面
3. 总共筛选了63种基于20种支架的设计。在这一轮设计中，DBR3_01在酵母展示实验中表现出微弱的结合活性。此外，DBR3_01与ACE2展示出了竞争性结合，表明结合物正在针对正确的RBD位点。
4. 生成两个突变库来提高设计的结合亲和力：首先，准备了一个在设计的接口中的定向突变库，得到了有四个突变的DBR3_02，并使用SPR确定了解离常数（KD）为4.6µM。其次，筛选了一个位点饱和突变（SSM）库，富集了三个点突变体，其中一个与第一个库的突变重合。将这三个突变体添加到DBR3_02中，得到了KD为80 nM的DBR3_03，其稳定折叠。

Binding seed database

α-螺旋种子库生成

下载PDB的非冗余集，并将其分解为α-螺旋，删除了所有非螺旋元素。使用DSSP程序根据其二级结构为每个残基打上标签。提取带有连续十个或更多个带有DSSP分配的螺旋(H)标签的残基的片段。将每个提取的螺旋片段视为单体蛋白质，并为每个片段计算表面特征。然后对所有提取的螺旋进行了MaSIF-search指纹和MaSIF-site标签的计算。MaSIF-seed使用指纹相似性和界面亲和性来识别适合的种子。最终，binding seed数据库由约250,000个螺旋motif组成，从中提取了约1.4亿个指纹。

β-折叠片段种子库生成

为了收集β-折叠片段，使用MASTER软件对PDB的非冗余集进行预处理，以实现快速结构匹配。两个模板motif，一个由两个β-链组成，一个由三个β-链组成，剥离了loop作为输入提供给MASTER，以查找结构相似的motif，最终成为MaSIF的motif数据集。搜索允许模板中连接β-链的骨架长度在1-10个氨基酸之间变化。两链β-折叠和三链β-折叠的RMSD截止值分别设为2.1 Å和3 Å。与准备螺旋motif类似，每个β-片段被视为单体蛋白质，并生成表面特征，随后生成MaSIF-search指纹和MaSIF-site标签。最终，β-链binding seed数据库包含约390,000个motif，从中提取了约2.6亿个指纹。

seed嫁接以及计算设计

从每个解空间中选择一个代表性的种子，然后使用Rosetta MotifGraft将其与1,300个单体支架数据库匹配，以便进行RBD和PD-L1设计。对于优化，选择的种子被嫁接到一个由PDB、两个计算设计的小蛋白数据库和一个AF2蛋白质组预测数据库组成的4,347个小球形蛋白质数据库（<100aa）。在嫁接之前，种子被裁剪到最少的接触侧链数。此外，基于β-片段的seed的loop区域被完全去除。在Rosetta（v.3.13）进行侧链嫁接之后，随后设计其余的interface。最终的设计是基于Rosetta结合能、形状互补性、氢键数和埋藏的未满足极性原子数量进行实验表征的选择。