榕树集-Rosetta MotifGraft

DrugScience

发布于 2023-05-24 10:25:23

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发布于 2023-05-24 10:25:23

文章被收录于专栏：DrugScience

简介：

蛋白质界面（protein interface）是指两个或更多蛋白质之间的接触面或结合区域。它们是蛋白质相互作用的关键部分，可以调节细胞功能的许多重要过程，如信号传导、代谢、免疫反应和细胞黏附。蛋白质界面的形状、化学特性和静电性质等因素对于蛋白质的相互作用方式和特异性都有着重要的影响。由于蛋白质界面在生物学和生物医学中的重要性，因此研究蛋白质界面的结构和功能已成为生物学、生物医学、生物信息学和药物设计领域的热门课题。

蛋白质设计者通常采用“seeded interface design”方法，即使用一个已知结构中的小型motif来结合目标位点（target site），从而启动设计过程。然后将该motif 嫁接/移植（graft）到较大的蛋白质支架（scaffold）中，以实现优秀的packing 和优化相互作用界面。

优点：

通过从已知结合目标区域的结构域（Motif）开始设计，设计的初始阶段便具有了一些有利的相互作用，
支架（Scaffold）和目标蛋白表面的取向受到结合结构域（Motif）本身的影响。通过使用这些信息，设计偏向于采样少量的合理的对接构象，而并非从头猜测结合构象。

注：以下内容建立在你已经安装好Rosetta的基础上，请事先安装

Motif Grafting 工作流程

包括以下步骤：

定义结合Motif 。
准备蛋白质骨架（scaffold）数据库。
匹配可能的蛋白质 Motif（即Motif Grafting）。
序列设计。
选择和改进设计。

案例

蛋白信息

PDB：1GWQ

ERα是一种被类固醇激活的转录因子，通过招募共激活因子到靶基因。ERα共激活因子相互作用是通过一个具有LXXLL特征序列（其中L代表亮氨酸，X代表任何氨基酸）的螺旋Motif建立的，其中Leu 亮氨酸残基（热点氨基酸）与ERα表面的疏水裂缝结合。

本案例将展示如何将这个螺旋Motif 嫁接到一个新的蛋白质Scaffold上。

假设

通过将LXXLL motif 嵌入一个稳定的scaffold中来使得结合构象整体稳定，与LXXLL motif 存在于柔性肽相比，减少了熵惩罚。
扩大界面接触面积可以创建和靶标蛋白之间新的相互作用

准备蛋白文件：

一般情况处理一下蛋白质文件，当然有教程显示你也可以不做，如果你做了MD也可以，假如你有其余方式优化结构也可以。。。

从PDB数据库中下载1GWQ的PDB格式文件，下载过程不再赘述除去水分子以及配体分子这里你可以使用PyMol等可视化工具进行去除（不在赘述），也可以使用脚本，无所谓。介绍脚本的使用方法:for i in *.pdb; do grep "ATOM "
截取出Context（Target，Chain A）蛋白和Motif（包含LXXLL，Chain C）蛋白。因为他是个Dimer所以理论上左右两侧的都可以 context.pdb

motif.pdb ‍

准备Scaffold数据库

为了准备一个可以搜索各种结构Motif的Scaffold数据库，从PDB数据库中下载，按照四个标准进行过滤：

具有高分辨率X射线衍射数据的晶体结构（<2.5Å）
大肠杆菌中表达
单个蛋白质链在不对称单元中（MotifGraft仅适用于单体支架作为移植靶标）
没有结合的配体或氨基酸修饰

可以自己构建，不过这些过滤没有什么特别之处，找之前的旧版本作为测试使用是OK的。或者直接找一些Online的工具进行搜索。

准备好的：https://meilerlab.org/wp-content/uploads/2022/02/scaffolding-1.zip

Online搜索工具：

Frag’R’Us server： http://www.bioinsilico.org/FRAGRUS
MASTER：https://grigoryanlab.org/master/

这里直接使用准备好的，准备好的Scaffold 需要使用Rosetta进行能量最小化以便减少一些结构上的冲突，可以采用relax进行最小化操作，也可以使用Rosetta script XML code，或者其余方式。

Realx操作

ls -1 *.pdb >pdb_files.list
${Rosetta}/main/source/bin/relax.macosclangrelease -database ${Rosetta}/main/database/ -ignore_unrecognized_res -relax:constrain_relax_to_start_coords -ex1 -ex2 -use_input_sc -l pdb_files.list

这里采用已经处理好的：

PyMOL看两眼

左下角是Motif.pdb,其余全都为SideChainGraft中的Scaffolds

将其与Motif进行Super，长着白角的就是

Motif Grafting and Interface Design

基元移植（Motif Grafting）和蛋白质界面设计（Interface Design）是不同的两个不同的概念，但由于RosettaScripts的灵活性，两者可以包含在单个计算步骤中。

由于Side Chain Graft（侧链移植）和Backbone Graft（主链移植）的支架匹配（Scaffold Match）不同，因此首先将使用Side Chain Graft程序。

Side Chain Graft

注：建议在尝试Motif 时先尝试Side Chain Graft，因为Side Chain Graft对蛋白质支架(Scaffold)的改变较少，在实验验证期间获得正确折叠设计的机会要比Main Chain Graft高。

构建一个scaffol list，如果觉得不放心，自己改成绝对路径

ls ../scaffolds/*.pdb > scaffolds.list
cat scaffolds.list

../scaffolds/1ji6_0001.pdb
../scaffolds/1lp1_0001.pdb
../scaffolds/1pze_0001.pdb
../scaffolds/1qkk_0001.pdb
../scaffolds/1srv_0001.pdb
../scaffolds/1tk1_0001.pdb
../scaffolds/1x1h_0001.pdb
../scaffolds/1yo7_0001.pdb
../scaffolds/2b81_0001.pdb
../scaffolds/2j5y_0001.pdb
../scaffolds/2xj4_0001.pdb
../scaffolds/3cxr_0001.pdb
../scaffolds/3fbl_0001.pdb
../scaffolds/3mix_0001.pdb
../scaffolds/3vbc_0001.pdb
../scaffolds/4e6h_0001.pdb
../scaffolds/4tve_0001.pdb
../scaffolds/4xwu_0001.pdb

创建MotifGraftsc.xml,官方已经给出,XML的学习知识见参考。

<ROSETTASCRIPTS>
  <TASKOPERATIONS>
    <ProteinInterfaceDesign  name="pido"  repack_chain1="1" repack_chain2="1" design_chain1="0" design_chain2="1" interface_distance_cutoff="8.0"/>
    <OperateOnCertainResidues name="hotspot_repack">
    <ResiduePDBInfoHasLabel property="HOTSPOT"/>
    <RestrictToRepackingRLT/>
    </OperateOnCertainResidues>
  </TASKOPERATIONS>
  <SCOREFXNS>
  </SCOREFXNS>
  <FILTERS>
    <Ddg name="ddg" confidence="0"/>
    <BuriedUnsatHbonds name="unsat" confidence="0"/>
    <ShapeComplementarity name="Sc" confidence="0"/>
  </FILTERS>
  <MOVERS>
    <MotifGraft name="motif_grafting" context_structure="context.pdb" motif_structure="motif.pdb" RMSD_tolerance="0.3" NC_points_RMSD_tolerance="0.5" 
     clash_score_cutoff="5" clash_test_residue="GLY" hotspots="3:7" combinatory_fragment_size_delta="2:2" full_motif_bb_alignment="1" graft_only_hotspots_by_replacement="1" revert_graft_to_native_sequence="1"/>
    <build_Ala_pose name="ala_pose" partner1="0" partner2="1" interface_cutoff_distance="8.0" task_operations="hotspot_repack"/>
    <Prepack name="ppk" jump_number="0"/>
    <PackRotamersMover name="design" task_operations="hotspot_repack,pido"/>
    <MinMover name="rb_min" bb="0" chi="1" jump="1"/>
  </MOVERS>
  <PROTOCOLS>
    <Add mover_name="motif_grafting"/>
    <Add mover_name="ala_pose"/>
    <Add mover_name="ppk"/>
    <Add mover_name="design"/>
    <Add mover_name="rb_min"/>
    <Add mover_name="design"/>
    <Add filter_name="unsat"/>
    <Add filter_name="ddg"/>
    <Add filter_name="Sc"/>
  </PROTOCOLS>
</ROSETTASCRIPTS>

使用MotifGraftsc.xml,注意修改其中的motif.pdb和scaffold.pdb的文件路径‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍

rosetta_scripts.static.macosclangrelease -l scaffolds.list -use_input_sc -ex1 -ex2 -nstruct 1 -parser:protocol MotifGraft_sc.xml

失败的案例各有各的失败，但是假如你运行成功了，应该就会出现以下界面。

以及以下这些文件：

cat score.sc
SEQUENCE:
SCORE: total_score          Sc         ddg dslf_fa13    fa_atr    fa_dun   fa_elec fa_intra_rep fa_intra_sol_xover4              fa_rep              fa_sol graft_RMSD graft_clashScore graft_max_motif_fragment_RMSD hbond_bb_sc hbond_lr_bb    hbond_sc hbond_sr_bb lk_ball_wtd       omega     p_aa_pp pro_close rama_prepro         ref       unsat yhh_planarity graft_full_bb_mode graft_in_motif_ranges graft_in_scaffold_ranges graft_out_scaffold_ranges graft_scaffold_size_change description
SCORE:   -2271.973       0.524      -7.997     0.000 -5128.790  1028.353 -1465.508        9.988             161.151             711.191            3061.067      0.171            2.000                         0.000    -147.202    -177.446    -142.286    -339.808    -116.419      55.667    -116.565     5.588      42.762     284.196     112.000         2.089                  1                   3,7                    62,66                   305,309                          0 1ji6_0001_0001
SCORE:    -679.022       0.668     -24.194     0.000 -1781.796   372.821  -507.127        3.393              53.867             258.088            1106.464      0.148            0.000                         0.000     -35.392      -5.873     -21.367    -178.791     -49.345      10.669     -30.426     2.976      -0.328     123.146      30.000         0.000                  1                   3,7                      4,8                   247,251                          0 1lp1_0001_0001

随意截取了一个成品，长角的便是Motif.pdb

截取出原始的Motif和嫁接之后的Super了一下

选择以及优化设计

迄今为止，还没有一种计算方法能够完美准确地预测哪些设计在实验中会具有活性（即便AI也一样）。因此，指定多个标准来选择具有良好属性的设计序列是非常明智的。

1. 根据计算出的Interface指标对设计进行筛选，例如：a favorable binding energy (有利的结合能，ddG < 0 ROSETTA energy units，最好比天然界面的能量更低），high shape complementarity (高形状互补性，Sc>0.65), a low number of buried unsatisfied hydrogen-bonding atoms（较少的埋藏的未满足氢键原子数量）。可以从score.sc中看到这些指标并进行选择。

2. 一旦根据上述指标选择了一组设计，进行人为辅助的设计结构检查便显得非常重要。存在一些结构生物学家能够看到，但是并不包含在在标准指标中影响因素。例如：ROSETTA 设计结构中的两个常见缺陷需要避免：i）埋藏的带电残基和 ii）由丙氨酸残基占主导的未充分packed的Interface。

3. 将设计还原为天然氨基酸：还要考虑设计的Scaffold是否能够折叠到其预期的结构；如果在实验环境中无法将蛋白质折叠成预期的结构，则计算模型上再完美的接口也是完全没有意义的。这对于具有大量疏水残基主导的Interface设计尤其成问题。通常认为，设计出的序列正确折叠的概率与在设计过程中对Scaffold施加的突变数呈反比关系。因此，通过将序列上的氨基酸恢复为其自然序列以尽可能的减少变异是非常有意义的。

你可以按照以下方式进行尝试

cat context.pdb ../scaffolds/1ji6_0001.pdb > nativecplx.pdb
revert_design_to_native.static.macosclangrelease -revert_app:wt nativecplx.pdb revert_app:design 1ji6_0001_0001.pdb -ex1 -ex2  -use_input_sc > revert.log
revert_design_to_native.static.macosclangrelease \
-revert_app:wt nativecplx_2.pdb -revert_app:design 1ji6_0001_0001.pdb -ex1 -ex2 \
-use_input_sc > revert.log

4. 手动调整设计：用户可能希望纠正ROSETTA设计中的一些常见问题，比如暴露在界面边缘可能接触水的疏水性残基，将其修改为自然序列，将埋藏的带电氨基酸突变为疏水性氨基酸等。手动改进设计中没有硬性规则，仅仅取决于设计者的个人喜好和经验。

5. 基于折叠概率筛选设计：许多设计的序列在实验测试中可能无法正确折叠，用Alphafold2或者RosettaFold进行再次验证。

附录

Backbone Graft

步骤同Side Chain Graft，XML code有差异

<ROSETTASCRIPTS>
<TASKOPERATIONS>
  <ProteinInterfaceDesign name="pido_far" interface_distance_cutoff="15.0"/>
  <ProteinInterfaceDesign name="pido_med" interface_distance_cutoff="12.0"/>
  <ProteinInterfaceDesign name="pido_near" interface_distance_cutoff="8.0"/>
  <OperateOnCertainResidues name="hotspot_repack">
    <ResiduePDBInfoHasLabel property="HOTSPOT"/>
    <RestrictToRepackingRLT/>
  </OperateOnCertainResidues>
  <SelectBySASA name="core" mode="sc" state="bound" probe_radius="2.2" core_asa="0" surface_asa="30" core="1" boundary="0" surface="0"/>
  <SelectBySASA name="core_and_boundary"  mode="sc" state="bound" probe_radius="2.2" core_asa="0" surface_asa="30" core="1" boundary="1" surface="0"/>
</TASKOPERATIONS>
<SCOREFXNS>
</SCOREFXNS>
<FILTERS>
  <Ddg name="ddg" confidence="0"/>
  <BuriedUnsatHbonds name="unsat" confidence="0"/>
  <ShapeComplementarity name="Sc" confidence="0"/>
</FILTERS>
<MOVERS>
  <MotifGraft name="motif_grafting" context_structure="context.pdb" motif_structure="motif.pdb" RMSD_tolerance="1.0" NC_points_RMSD_tolerance="1.0" 
   clash_score_cutoff="5" clash_test_residue="GLY" hotspots="3:7" combinatory_fragment_size_delta="2:2" max_fragment_replacement_size_delta="-8:8" full_motif_bb_alignment="0" graft_only_hotspots_by_replacement="0"/>
   <build_Ala_pose name="ala_pose" partner1="0" partner2="1" interface_cutoff_distance="8.0" task_operations="hotspot_repack"/>
   <Prepack name="ppk" jump_number="0"/>
   <PackRotamersMover name="design_core" task_operations="hotspot_repack,pido_far,core"/>
   <PackRotamersMover name="design_boundary" task_operations="hotspot_repack,pido_med,core_and_boundary"/>
   <PackRotamersMover name="design_interface" task_operations="hotspot_repack,pido_near"/>
   <MinMover name="sc_min" bb="0" chi="1" jump="1"/>
</MOVERS>
<PROTOCOLS>
  <Add mover_name="motif_grafting"/>
  <Add mover_name="ala_pose"/>
  <Add mover_name="ppk"/>
  <Add mover_name="design_core"/>
  <Add mover_name="design_boundary"/>
  <Add mover_name="design_interface"/>
  <Add mover_name="sc_min"/>
  <Add filter_name="unsat"/>
  <Add filter_name="ddg"/>
  <Add filter_name="Sc"/>
</PROTOCOLS>
</ROSETTASCRIPTS>