Sanger法是基于DNA合成反应的测序技术,又称为SBS法、末端终止法。1975年由Sanger提出,并于1977发表第一个完整的生物体基因组序列。
核心原理:由于双脱氧核苷酸(ddNTP)的3’位置脱氧,其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键,因此可以用来中断DNA合成反应,在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP(分为:ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP),通过凝胶电泳和放射自显影,根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列。
在每个反应体系中,ddNTP相对于dNTP是很少的,所以只有部分新链在不同的位置特异性终止,最终就会得到一系列长度不一的序列。
基本原理:将dNTP的3'-OH以叠氮集团RTG(Reversible Terminating Group,可逆末端基团)进行修饰;将4种碱基分别与不同的荧光分子连接;DNA合成时,RTG能起到类似于ddNTP的作用终止反应;每次合成反应终止并读取信号之后,洗脱RTG和荧光分子,进行下一轮循环。
主要过程:
a, DNA待测文库构建
利用超声波把待测的DNA样本打断成小片段,并在这些小片段的两端添加上不同的接头,构建出单链DNA文库。这些文库中的DNA在通过flowcell(吸附流动DNA片段的槽道)时会随机附着在flowcell表面的channel上。每个Flowcell有8个channel,每个channel的表面都附有很多接头,这些接头能和建库过程中加在DNA片段两端的接头相互配对,并能支持DNA在其表面进行桥式PCR的扩增。
b,c 桥式PCR以Flowcell表面所固定的接头为模板,进行桥形扩增。经过不断的扩增和变性循环,最终每个DNA片段都将在各自的位置上集中成束,每一个束都含有单个DNA模板的很多份拷贝,进行这一过程的目的在于实现将碱基信号强度放大,以达到测序所需的信号要求。
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