实操分享-使用MAGeCK分析Bulk CRISPR Screen数据
实操分享-使用MAGeCK分析Bulk CRISPR Screen数据
1- 前言 工具介绍
CRISPR 不需要多说
关于MAGeCK（取自Chat GPT3.5）
MAGeCK (Model-based Analysis of Genome-wide CRISPR-Cas9 Knockout): MAGeCK是一个用于分析CRISPR-Cas9基因敲除筛选数据的计算工具。它能够从大规模CRISPR筛选实验的测序数据中，鉴定出在细胞生存或增殖中起关键作用的基因。
补充：是刘小乐（Xiaole Shirley Liu）教授课题组开发的。
2- MAGeCK 学习资料
用到的资料：
官方的示例数据和代码
https://sourceforge.net/p/mageck/wiki/Home/
以下公众号文章
《CRISPR文库筛选分析1 MAGeck 学习笔记 (qq.com)》
3- MAGeCK的安装
conda create -c bioconda -n mageckenv mageck # 环境中python版本要大于3
source activate mageckenv
conda update mageck
source deactivate
4- 学习MAGeCK手册
从官方说明看分析一共5个步骤
1- 下载数据
2- 准备library文件
3- 确定接头长度（选做）
4- 运行mageck count
5- 运行mageck test
4.1 Step1 准备数据
推荐大家使用kingfisher下载，参考推文
《小鼠的5个样品的10x技术单细胞转录组上游定量（文末赠送全套代码） (qq.com)》
示例数据下载&解压
kingfisher get -r ERR376998 ERR376999 -m ena-ascp ena-ftp prefetch aws-http
gunzip ERR376998.fastq.gz
gunzip ERR376999.fastq.gz
4.2 Step2 准备library文件
目的：library文件让MAGeCK 知道哪个 sgRNA 靶向哪个
基因文库地址：
MAGeCK - Browse /libraries at SourceForge.net
https://sourceforge.net/projects/mageck/files/libraries/
下载这个
格式：
4.3 Step3 准备接头长度参数
选做的理由：自0.5.6版本以来，MAGeCK 现在能够自动确定修剪长度和 sgRNA 长度，在大多数情况下。因此，您不需要执行此步骤，除非 MAGeCK 本身无法执行此步骤。
出于步骤完整，展示一下作者示例 作者的示例
前23位重复，去掉接头
如何去掉？
在mageck count中设置(--trim-5 23)参数，
看接下来的代码
4.4 Step4 mageck count的使用
目的：输出library文件中包含的基因的表达量。
准备好3个条件，我们就开始使用mageck count函数
注意：library文件和原始数据要在一个文件夹里面
mageck count -l yusa_library.csv -n escneg --sample-label "plasmid,ESC1" --trim-5 23 --fastq ERR376998.fastq ERR376999.fastq
代码参数说明：
# 'mageck count' 命令名称
# '-l yusa_library.csv' Step2 准备的library文件名
# '-n escneg'输出结果文件名,输出文件名为escneg.count.txt
# '--sample-label "plasmid,ESC1"',告诉mageck你的实验分组与样本号一一对应
# '--trim-5 23' Step3 设置去接头（可选）
# '--fastq ERR376998.fastq ERR376999.fastq' Step1下载&解压的原始数据
escneg.count.txt(结果文件)展示：
sgRNA Gene plasmid ESC1
chr19:5884430-5884453 SLC25A45 13 32
chr11:58831475-58831498 OLFR312 94 108
chr4:49282352-49282375 E130309F12RIK 85 128
4.5 Step5 mageck test的使用
目的：比较实验组与对照组，看基因的正表达和负表达
代码如下：
mageck test -k escneg.count.txt -t ESC1 -c plasmid -n esccp
代码参数说明：
# 'mageck test' 命令名称
# '-k escneg.count.txt' mageck count的结果
# '-t ESC1',告诉mageck你的实验组是谁，名称与escneg.count.txt列名对应
# '-c plasmid',告诉mageck你的对照组是谁，名称与escneg.count.txt列名对应
# '-n esccp' 设置输出文件名为'esccp.gene_summary.txt'
输出结果
id num neg|score neg|p-value neg|fdr neg|rank neg|goodsgrna pos|score pos|p-value pos|fdr pos|rank pos|goodsgrna
GTF2B 5 2.0462e-10 2.5851e-07 0.000707 1 5 1.0 1.0 1.0 19150 0
RPS5 5 5.9353e-10 2.5851e-07 0.000707 2 5 1.0 1.0 1.0 19149 0
RPL19 4 2.695e-09 2.5851e-07 0.000707 3 4 1.0 1.0 1.0 19148 0
KIF18B 5 1.0136e-08 2.5851e-07 0.000707 4 5 1.0 1.0 1.0 19146 0
5- 补充，MAGeCK实操分享
这样基本的代码说明完了，
在实操中有个点想分享给大家
library文件不一定要用MAGeCK的官方文件
叠个甲：刚接触，有什么不对劲的地方欢迎和谐交流。
MAGeCK提供的library如下
Addgene提供的library文件经过编辑也可以使用，拓充了我们library的库~
链接：
Addgene: Broad GPP - Mouse Genome-wide CRISPR knockout pooled libraries
https://www.addgene.org/pooled-library/broadgpp-mouse-knockout-brie/
下载library
读到R里面看一下，选择自己需要的列
rm(list = ls())
library(dplyr)
f=read.delim('broadgpp-brie-library-contents.txt')
取需要的列，改名
convert=f[,c("Position.of.Base.After.Cut..1.based.","sgRNA.Target.Sequence","Target.Gene.Symbol")]
colnames(convert)=c("Gene_ID","sgRNA_sequence","sgRNA_Target_gene")
结果：
为保持与参考library格式一致，修改第一列名字
convert$Gene_ID=paste0("s_",convert$Gene_ID)
library文件：
后续经过mageck count和mageck test
获得如下图基因上下调的数据
腾讯云开发者
