单细胞免疫组库VDJ|从数据下载开始完成cellranger vdj分析（1）

单细胞免疫组库可以额外做啥？

scTCR可以更细致的获取肿瘤免疫微环境的变化，比如单细胞转录组可以获取不同样本，不同分组（癌和癌旁，是否治疗，是否响应）的celltype组成，可以知道哪些celltype发生变化。

而TCR可以进一步的得知发生变化的celltype中clone扩展情况如何，治疗响应组中clone是变多了还是变少了？不同celltype之间是否共享一些clone？是否出现了noval的clone？clone最多的TCR序列是哪些？这些序列和哪些peptide结合最强？是否可以用于CAR-T或者TAR-T治疗等等。

本系列会使用2021年Cancer Cell文章“Single-cell sequencing links multiregional immune landscapes and tissue-resident T cells in ccRCC to tumor topology and therapy efficacy”中的部分样本作为示例展示TCR的常见应用场景以及可视化。

该数据集的多个样本都有多处采样位置，多数样本同时含有RNA和TCR数据，且含有治疗前后的数据，ICB响应与否的数据，非常适合免疫组库系列分析的练习。

一 数据集下载

Pubmed中找到该文章，然后在Data Availability Statement 中发现文章的原始数据在PRJNA705464，下载原始的sra文件来开启 “从0开始scVDJ”的系列分析。

1，数据集下载

在浏览器输入https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/study/，在Accession 中输入BioProject的ID号（PRJNA705464）， 下拉找到以下信息，就可以开始下载了，介绍以下两种下载方式

（1）可以点击具体的Run，然后找到Data Access ，获取下载链接后进行下载。

（2）也可以获取第一列的SRR信息，使用SRAToolkit的prefetch进行批量下载

1.1 安装SRAToolkit

可以在https://github.com/ncbi/sra-tools/wiki/01.-Downloading-SRA-Toolkit的链接中选择合适的SRAToolkit下载 或者通过wget方式获取

wget https://ftp-trace.ncbi.nlm.nih.gov/sra/sdk/3.0.2/sratoolkit.3.0.2-centos_linux64.tar.gz
tar zxvf sratoolkit.3.0.2-centos_linux64.tar.gz

1.2 prefetch下载数据

（1）单个Run下载

prefetch 后面添加上SRR的ID号即可 ，prefetch建议使用绝对路径 , 可以添加--max-size 100G 参数。

/path/prefetch SRR13806045  --max-size 100G

（2）SRR_ACC_List 批量下载（一列SRR编号的文件）

/path/prefetch --option-file SRR_ACC_List.txt

（3）shell循环下载

cat SRR_ACC_List.txt |while read i; do
/path/prefetch $i  
done

软件建议使用绝对路径。

2 sra文件转为fastq

使用sratoolkit中的fastq-dump命令将 sra 转化为 fastq 文件。

进入到sra数据的存储文件夹中，可以用下述代码进行批量的格式转化：

cat SRR_ACC_List.txt |while read i; do
/path/.../fastq-dump --split-3 $i 
done

注：--split-3 filename其中--split-3参数代表着如果是单端测序就生成一个 .fastq文件，如果是双端测序就生成_1.fastq 和*_2.fastq 文件。

3 修改cellranger 输入格式

得到fastq文件后，还需要转为cellrange 分析需要的格式（比如，将得到的SRR_1.fastq.gz改为SRR_S1_L001_I1_001.fastq.gz）。

可以使用上述方式进行批量修改，但是要注意生成文件的个数，如果像本示例中产生的是R1和R2文件，那就将原来_1的改成R1，将_2改成R2。

#创建SRR_ACC_List.txt ，内容为SRR号
cat SRR_ACC_List.txt| while read i ;do 
mv ${i}_1*.fastq.gz ${i}_S1_L001_R1_001.fastq.gz;
mv ${i}_2*.fastq.gz ${i}_S1_L001_R2_001.fastq.gz);
done

注：样本名称不要有下划线"_"，可以是短线"-"。

二 cellranger分析

首先进行cellranger的下载和安装，参照10X官网https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/using/tutorial_in 或者 单细胞工具箱|Cell Ranger-V6.0 开启单细胞之旅（上）

1 scRNA分析

首先下载refdata文件，然后解压

wget https://cf.10xgenomics.com/supp/cell-exp/refdata-gex-GRCh38-2020-A.tar.gz 
tar -zxvf refdata-gex-GRCh38-2020-A.tar.gz

进行cellranger count分析

/path/cellranger count --id=sample1 \
                   --transcriptome=/path/.../refdata-gex-GRCh38-2020-A \
                   --fastqs=/path/.../fastq_path \
                   --sample=sample1 \
                   --expect-cells=1000 \

运行结果在outs文件夹，建议每个文件都在官网中查一下大概的含义，这里重点关注outs/filtered_feature_bc_matrix文件夹， 单细胞工具箱|Cell Ranger-V6.0 开启单细胞之旅（上）

2 scVDJ分析

首先下载V(D)J reference文件，然后解压

curl -O https://cf.10xgenomics.com/supp/cell-vdj/refdata-cellranger-vdj-GRCh38-alts-ensembl-5.0.0.tar.gz 
tar -xf refdata-cellranger-vdj-GRCh38-alts-ensembl-5.0.0.tar.gz

进行cellranger vdj分析

/path/cellranger vdj --id=sample1 \
      --reference=/path/.../refdata-cellranger-vdj-GRCh38-alts-ensembl-5.0.0 \
      --fastqs=/path/.../data \ #fastq文件所在路径
      --sample=sample1 \ #第一个下划线之前的样本信息
      --localcores=8 \
      --localmem=64 \

运行结果在outs文件夹，文件很多，建议根据https://support.10xgenomics.com/single-cell-vdj/software/pipelines/latest/output/overview了解以下每个文件的意义。outs/filtered_contig_annotations.csv文件，更需要重点了解每一列的意义。

以上，得到每个样本的单细胞RNA和TCR的结果后就可以使用scRepertoire 或者STARTRAC 进行免疫组库以及T细胞动态等分析了。

这些分析后续会进行系统的介绍。

参考资料：Single Cell Immune Profiling - Official 10x Genomics Support