空转 | 我，SPOTlight，用解卷积，解决空间转录组spot注释！

生信补给站

发布于 2023-08-25 10:33:35

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发布于 2023-08-25 10:33:35

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前面介绍过整合scRNA-seq和空间转录组数据主要有（1）映射（Mapping）和（2）去卷积（Deconvolution）两种方法。前面空转 | 结合scRNA完成空转spot注释（Seurat Mapping） & 彩蛋（封面的空转主图代码）介绍了使用Seurat Mapping的方式进行spot注释，本文介绍一种经典的解卷积方法-SPOTlight。

一载入R包，数据

直接使用前面Seurat空转得到的空转和单细胞转录组的结果。

library(SPOTlight)
library(Seurat)
library(ggplot2)
library(SingleCellExperiment)
library(scater)
library(scran)

#load data
load("Brain_ST_scRNA.sBio.Rdata")
head(Brain_scRNA)
head(Brain_ST)

准备工作详见前面，单细胞数据最好完成了注释。

二 SPOTlight 分析

1，数据处理

先将数据转为SingleCellExperiment 对象，然后按照官网文档https://github.com/MarcElosua/SPOTlight/blob/HEAD/vignettes/SPOTlight_kidney.Rmd 进行处理

sce <- as.SingleCellExperiment(Brain_scRNA)

### Feature selection
sce <- logNormCounts(sce)

### Variance modelling
# 去掉核糖体和线粒体基因
genes <- !grepl(pattern = "^RP[L|S]|MT", x = rownames(sce))
dec <- modelGeneVar(sce , subset.row = genes)

# 计算高变基因
hvg <- getTopHVGs(dec, n = 3000)

# 加上细胞注释信息
colLabels(sce) <- colData(sce)$celltype

# Compute marker genes
mgs <- scoreMarkers(sce, subset.row = genes)

# 保留最相关的marker基因
mgs_fil <- lapply(names(mgs), function(i) {
  x <- mgs[[i]]
  # Filter and keep relevant marker genes, those with AUC > 0.8
  x <- x[x$mean.AUC > 0.8, ]
  # Sort the genes from highest to lowest weight
  x <- x[order(x$mean.AUC, decreasing = TRUE), ]
  # Add gene and cluster id to the dataframe
  x$gene <- rownames(x)
  x$cluster <- i
  data.frame(x)
})
mgs_df <- do.call(rbind, mgs_fil)

使用lapply函数批量得到每种celltype的marker 基因，这里是根据AUC的阈值（0.8）进行筛选，其中0.8 可以根据需要自行更改。

2，SPOTlight分析

使用SPOTlight主函数进行分析，注新版本的是SPOTlight函数，而不是spotlight_deconvolution函数了。

### Deconvolution
res <- SPOTlight(
  x = sce, 
  y = Brain_ST,
  groups = as.character(sce$celltype), # 也可以是cluster，
  mgs = mgs_df,
  hvg = hvg,
  weight_id = "mean.AUC",
  group_id = "cluster",
  gene_id = "gene")
  
#Extract data from `SPOTlight`:
str(res) #查看结果类型 
decon_mtrx <- res$mat
#这里重命名，非必要
colnames(decon_mtrx) <- paste(colnames(decon_mtrx),"Spotlight",sep = "_")

结果得到的是每个spot的各个celltype的占比，这里重命名是为了区分（比如后面使用其他方法进行注释）。

和Seurat一致，也可以2种保存方式

（1）添加至metadata.

（2）虽然res 不是SeuratObject ，但是也可以构建为新的slot 。

#meta 方式添加
Brain_ST@meta.data <- cbind(Brain_ST@meta.data, decon_mtrx)
head(Brain_ST)

#构建新的 slot
Brain_ST[["SPOTlight"]] <- CreateAssayObject(t(res$mat))
DefaultAssay(Brain_ST) <- "SPOTlight"

三 SPOTlight 结果可视化

1，提取SPOTlight结果

## 提取结果
head(mat <- res$mat)[, seq_len(length(unique(sce$celltype)))]
mod <- res$NMF

res.data <- (mat <- res$mat)[, seq_len(length(unique(sce$celltype)))]

2，topic对细胞类型的拟合情况

使用plotTopicProfiles 函数绘制拟合情况图

## 检查topic对细胞类型的拟合情况
plotTopicProfiles(
  x = mod,
  y = sce$celltype,  #
  facet = FALSE,
  min_prop = 0.01,
  ncol = 1) +
  theme(aspect.ratio = 1)

3，Correlation Matrix 和 Co-localization

## Spatial Correlation Matrix
p1 <- plotCorrelationMatrix(mat)
## Co-localization
p2 <- plotInteractions(mat, "heatmap")
plotInteractions(mat, "network")

4，Scatterpie 饼图

这时SPOTlight 注释spot后的核心图，将每个spot中的各celltype比例绘制为饼图，可以绘制到切片tiff背景上（左图），也可以同样的形状绘制在白板上（右图）。

ct <- colnames(mat)
mat[mat < 0.1] <- 0
#自定义颜色
paletteMartin <- c(
  "#000000", "#004949", "#009292", "#ff6db6", "#ffb6db", 
  "#490092", "#006ddb", "#b66dff", "#6db6ff", "#b6dbff",
  "#920000", "#924900", "#db6d00", "#24ff24", "#ffff6d")
pal <- colorRampPalette(paletteMartin)(length(ct))

names(pal) <- ct

p3 <- plotSpatialScatterpie(
  x = Brain_ST,
  y = mat,
  cell_types = colnames(mat),
  img = T, #以tiff为背景
  scatterpie_alpha = 1,
  pie_scale = 0.4, 
  # Rotate the image 90 degrees counterclockwise
  degrees = -90,
  # Pivot the image on its x axis
  axis = "h") +
  scale_fill_manual(
    values = pal,
    breaks = names(pal))
    
p4 <- plotSpatialScatterpie(
  x = Brain_ST,
  y = mat,
  cell_types = colnames(mat),
  img = FALSE,
  scatterpie_alpha = 1,
  pie_scale = 0.4) +
  scale_fill_manual(
    values = pal,
    breaks = names(pal))
p3 + p4

注意：（1）可以通过img 是否添加背景；

（2）pal 自定义颜色，注意长度与celltype个数一致；

（3）degrees 调整翻转角度和 tiff图片一致

5，批量绘制解析后的结果

前面Seurat的四彩蛋- 空转主图可视化部分了介绍了lapply 得到list然后自定义拼图的方式，这里介绍一下SpatialFeaturePlot进行绘制的方式。

注意要用 & 而不是 + ，否则后续的theme等设置只会对最后一张图有效果。

celltypes = rownames(Brain_ST)
SpatialFeaturePlot(Brain_ST, features = celltypes, 
                   pt.size.factor = 1.6, 
                   ncol = 4, 
                   crop = TRUE) &
  DarkTheme() &   
  theme(text=element_text(size=14)) & 
  theme(text=element_text(face = "bold")) &
  theme(legend.text=element_text(size=7))

https://github.com/satijalab/seurat/issues/3698 That is because of differences between patchwork and ggplot2. Simply use patchwork theming & instead of ggplot2 +.

参考资料：

https://github.com/MarcElosua/SPOTlight/blob/HEAD/vignettes/SPOTlight_kidney.Rm

本文参与腾讯云自媒体同步曝光计划，分享自微信公众号。

原始发表：2023-08-03，如有侵权请联系 cloudcommunity@tencent.com 删除

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