【Science】ChromEMT揭示纳米尺度染色质组织方式

科学问题

在人体细胞中，2米长的DNA通过与组蛋白和其他蛋白质的组装，在细胞核中形成染色质结构、百万碱基的三维区域和染色体，这些结构决定了我们基因组的活动和遗传特性。长期以来的教科书模型认为，11纳米的DNA-核心核小体聚合物首先组装成30纳米的纤维，进一步折叠成120纳米的染色体线状结构，然后形成300到700纳米的染色单体，最终形成有丝分裂染色体。根据这个模型，沉默的异染色质通常被描述为30纳米和120纳米的纤维。这种分层折叠模型基于纯化DNA和核小体形成的体外结构，以及在去除其他组分后观察到的经渗透处理的细胞中的染色质纤维。不幸的是，迄今为止还没有一种方法能够通过完整细胞的大型3D体积清晰地可视化和重建DNA和染色质的超微结构。因此，仍然存在一个问题，即在间期细胞和有丝分裂染色体中，决定人类基因组压缩和功能的核内局部和整体的3D染色质结构是什么？

解决方案

为了在细胞核中可视化和重建染色质的超微结构和多尺度的3D组织，我们开发了ChromEMT技术。该技术结合了电子显微镜层析成像（EMT）和一种标记方法（ChromEM），该方法能够选择性地增强DNA的对比度。这种技术利用一种与DNA结合的荧光染料，激发后催化二氨基苯胺聚合物在表面沉积，使染色质能够在电子显微镜中与OsO4一起被可视化。多角度层析成像技术的进展使我们能够揭示人类间期细胞和有丝分裂染色体中DNA的染色质超微结构和3D包装方式。

结果

ChromEMT技术可以在连续的切片中解析单个染色质链、异染色质区域和有丝分裂染色体的超微结构，并将它们的三维组织作为一个连续的整体可视化于原位的大型细胞核体积中。ChromEMT通过染色和检测从低渗溶解的鸡红细胞中纯化并经过MgCl2处理的细胞核中的30纳米纤维。然而，在人类间期和有丝分裂细胞中，我们并没有观察到高阶纤维的存在。相反，我们发现DNA和核小体组装成了直径在5到24纳米之间的无序链，具有不同的粒子排列、密度和结构构型。在间期细胞核中，染色质具有更加伸展的弯曲结构，而在有丝分裂染色体支架中则形成紧凑的环和相互作用的结构。为了分析染色质的压缩情况，我们创建了染色质体积浓度（CVC）的三维网格图。我们发现，间期细胞核中的亚体积CVC范围为12%到52%，并具有不同的空间分布模式，而有丝分裂染色体的亚体积CVC大于40%。

总结

染色质是一种灵活且无序的直径为5到24纳米的颗粒链，它在间期细胞核和有丝分裂染色体中以不同的浓度密度紧密组合在一起。染色质聚合物的总体主结构在有丝分裂染色体中并不改变，这有助于解释染色质凝缩的快速动态过程，以及表观遗传相互作用和结构如何通过细胞分裂进行遗传。与具有较长固定持久长度的刚性纤维不同，直径为5到24纳米的无序染色质链具有灵活性，可以以不同的长度弯曲，实现不同程度的压缩和高密度包装。染色质结构的多样性令人兴奋，并为如何通过DNA序列、相互作用、连接长度、组蛋白变异体和修饰的不同组合来精确调节核内基因组DNA的功能，从而指定细胞命运提供了结构基础。我们的数据还表明，与高阶折叠不同，核内以不同染色质浓度组装的三维区域决定了DNA的全局可访问性和活性。

技术概览

技术流程

1. 细胞在进行DRAQ5 DNA染色和光氧化之前会使用戊二醛进行固定。 2. 在附加的S1图中展示了DRAQ5 DNA标记可以在活细胞、用福尔马林或戊二醛固定的细胞中被激发光氧化DAB。 3. 为了染色'活'的U2OS细胞，在37°C下孵育10分钟，使用最终浓度为10μM的DRAQ5。 4. 细胞使用2.5%的高纯级戊二醛进行固定，并按照下述方法处理。 5. 此外，细胞还使用4%的高纯级福尔马林在室温下固定5分钟，并在冰上持续固定一个小时。 6. 细胞在不含钙和镁的Hank's平衡盐溶液中洗涤3次，然后在室温下使用5 mM的CaCl2、0.1 M的溴甘醇酸钠缓冲液中的2.5%高纯级戊二醛进行固定。 7. 细胞在0.1 M的溴甘醇酸钠缓冲液中洗涤五次，然后使用阻断缓冲液进行阻断。 8. 细胞使用DRAQ5在0.1%皂苷、0.1 M溴甘醇酸钠缓冲液中染色，然后用阻断缓冲液洗涤。 9. 洗去多余染料后，细胞在0.1 M溴甘醇酸钠缓冲液中浸泡在二氨基苯胺四盐酸盐中。 10. 细胞放置在设置在4℃的冷阶段的显微镜上，使用特定镜头和滤光片进行成像。 11. 细胞通过表面荧光照明进行光氧化处理，然后洗涤。 12. 细胞使用四氧化锇染色，然后进行洗涤。 13. 实验中的所有步骤都在低温条件下进行，液体和细胞都保持冷却状态。

文章来源：http://dx.doi.org/10.1126/science.aag0025