【Cell】R-Loop 从生理到病理（三）

R Loops在复制压力以及

基因组不稳定的源头作用

虽然在几个细胞过程中，有序的R环都是相关的，但不计划的R环会导致DNA损伤，最终导致基因组不稳定性。这首先在参与mRNP的生物合成和出口以及pre-mRNA剪接的基因突变中得到证实，这些突变显示出增加的R环，这与增加的DNA损伤和转录相关的重组相关（Huertas和Aguilera，2003年;Li和Manley，2005年;Paulsen等人，2009年）。这背后的一个原因可能依赖于R环的ssDNA纤维，它更易于核酸酶和基因毒性的作用（图3A）。然而，R环在细胞周期中的S-G2细胞引起基因组不稳定的最相关机制是其阻止RF进展的能力，可能导致叉断裂（图3B）。这一观点得到了许多不同研究的强烈支持，这些研究显示出通过R环富集区域的复制障碍，或者在细菌和酵母的R环积累突变体（Gan等人，2011年;Wellinger等人，2006年;Go ́mez-Gonza ́lez等人，2011年）中的复制障碍，或者通过在人类细胞中进行DNA梳理检测到的RFs的不对称性增加（Salas-Armenteros等人，2017年;Tuduri等人，2009年）。

复制通过转录染色质的困难是已知的基因组不稳定的来源。可能的是，R环本身或者与暂停的RNA聚合酶一起贡献到了RF阻塞。对这一模型的强有力的支持是，观察到缺失FA因子的细胞也积累了R环，如前所述，或者FACT染色质重塑复合体的消耗导致R环的积累和依赖R环的DNA损伤。FACT在转录延伸过程中在RNA聚合酶周围交换核小体，并在RF进展过程中防止R环介导的转录-复制冲突（Herrera-Moyano等人，2014年）。此外，对MCM2等位基因的分离功能的分析，该等位基因在复制应激下无法激活检查点，但完成正常复制，显示出携带这种检查点缺陷等位基因的酵母细胞也积累了DNA-RNA杂交体，这与损伤的增加相关，暗示了MCM复制解旋酶在防止转录-复制冲突中的作用（Vijayraghavan等人，2016年）。最后，PrimPol活性被描述为在R环阻碍了复制的位点重新建立复制（Svikovic'等人，2019年）。我们并不完全知道冲突在正常细胞中是如何或者以何种频率发生的，但肯定的是，在缺乏R环保护因子的细胞中，它可以被高度刺激（Domı ́nguez-Sa ́nchez等人，2011年;Stirling等人，2012年;Tuduri等人，2009年）。

转录和复制之间的冲突可以以两种模式发生，因为RNA聚合酶可以与复制叉的移动方向一致或者相反，这两种情况都有不同的结果。两篇关于细菌和酵母的报告提出，R环是转录-复制冲突的结果（Hamperl等人，2017年；Lang等人，2017年），条件是它们主要观察的是头对头冲突的系统，而非同向冲突。头对头冲突，而不是同向冲突，是转录介导的不稳定性的原因，这一点从酵母和细菌的研究结果中得到了证实（Prado和Aguilera，2005年；Mirkin和Mirkin，2005年），而最近在酵母中的研究结果表明，R环的形成与冲突的方向无关（Garcı ́a-Rubio等人，2018年）。然而，只有存在于头对头碰撞中的R环会导致停滞和损伤，而同向冲突中的则不会。如果一个DNA-RNA结合蛋白稳定了这样的R环，那么这些R环会构成复制的障碍，无论冲突的方向如何（图3B）。很可能的是，复制叉能够溶解R环，而不会发生永久性的停滞，除非R环被稳定或者被阻塞，比如在Yra1过量的酵母中（Garcı ́a-Rubio等人，2018年），或者在表达DNA-RNA杂交结构域-GFP（HB-GFP）融合蛋白的人类细胞中（Bhatia等人，2014年）。

最近在酵母中的全基因组分析显示，持续的R环是导致粗糙染色体重排的原因（Costantino和Koshland，2018年）。在脆弱位点的背景下，这个发现可能尤其相关，这些位点是基因组区域，通常包含重复的DNA序列，它们难以复制，并且在复制应激条件下发生DNA断裂。支持R环可能是影响转录-复制冲突作为脆弱性来源的一个因素的证据是，几个小组报告在脆弱位点上发现了R环的积累（Groh等人，2014年；Helmrich等人，2011年）。与此一致，众所周知，转录刺激三核苷酸重复序列的基因不稳定性，并且细菌和真核生物中的几项研究表明，在三核苷酸重复处的持久R环促进了这种不稳定性（Grabczyk等人，2007年；Kim和Jinks-Robertson，2011年；Reddy等人，2011年）。因此，体外转录的CG富集重复序列形成了RNase A抵抗和RNase H敏感结构，支持它们形成R环，因为RNase A会降解双链RNA，而RNase H会从DNA-RNA杂交中移除RNA。此外，CTG$CAG重复的不稳定性通过E. coli中RNase H1活性的降低以及通过在人类细胞中对RNase H1和H2的siRNA敲低而得到刺激（Lin等人，2010年）。

尽管并非所有的共有脆弱位点（CFSs）都可以由R环解释，但与转录影响脆弱性一致的是，已经显示出脆弱位点是特定于细胞类型的，因为有些位点在淋巴细胞中脆弱，但在成纤维细胞中则不脆弱，反之亦然。在每种细胞系中，脆弱位点都与染色质状态和基因表达相关（Letessier等人，2011年）。重要的是，缺乏与FA途径相关的蛋白质的细胞倾向于在CFSs处发生染色体断裂（Madireddy等人，2016年；Wang等人，2018a年）。在这种情况下，对FANCD2/淋巴母细胞的分析揭示，DNA-RNA杂交在CFS-FRA16D处积累。通过过表达RNase H移除R环，可以抑制在该CFS处观察到的复制扰动，这是通过单分子DNA复制分析（SMARD）显示的（Madireddy等人，2016年）。这可以推广到其他FA因子。因此，对源自CFS-FRA16D的AT富集序列Flex1的分析，该序列诱导HR介导的有丝分裂重组，显示FANCM和Rad52在保护CFSs中至关重要（Wang等人，2018a年）。因此，在复制应激条件下，存在易于诱导形成DSBs和染色体易位的区域，在许多情况下，这些区域与转录-复制冲突发生在R环富集位点的位置相关。

除了对复制叉（RFs）的影响外，特定的报告也提出了DNA损伤和基因组不稳定性可能在缺乏DNA复制的情况下也会发生的可能性。因此，已经提出由缺乏RNA处理因子积累的DNA-RNA杂交体被NER内切酶XPF和XPG主动处理成DSBs（Sollier等人，2014年；Brustel等人，2018年）。然而，新的报告表明R环依赖的DSBs需要复制。因此，已经显示在IgH基因座在类别转换重组（CSR）期间，DNA复制起源激活依赖于转录依赖的R环形成，它对有效的CSR是必需的（Wiedemann等人，2016年），并且XPG在复制中有一个不依赖核酸酶的作用（Trego等人，2016年）。因此，尚待确定的是NER内切酶是否协调DNA切割和DNA填充。

在DNA断裂处的DNA-RNA杂交：

修复中的正反作用

有几份报告揭示了DNA断裂，无论是单链还是双链，都是DNA-RNA杂交体形成的另一驱动力，如最近的评论所述（图4）（Aguilera and Go ́mez-Gonza ́lez，2017）。使用一个体外系统，由一个T7 RNA聚合酶在定义的Ig类切换底物上游，以阐明有助于R环形成的DNA特性，观察到非模板链上的单链DNA nick强烈刺激DNA-RNA杂交体形成（Roy et al.，2010）。同样，关于核糖核蛋白SAF-A/hnRNP U在DNA损伤反应（DDR）中的作用的分析建议在转录基因的断裂位点上有一个瞬时的转录依赖性DNA-RNA杂交体的积累（Britton et al.，2014）。此外，在哺乳动物细胞中，参与DDR的RNA解旋酶死亡盒1（DDX1）在IR后形成焦点；重要的是，这些焦点是R环依赖的，因为它们可以用RNase H或转录抑制剂处理来减少。实际上，在DDX1耗竭后，可以通过DRIP在DSB周围检测到R环（Li et al.，2016a）。这些数据支持结论，nicks和DSBs有利于RNA和模板链之间的杂交。

一个自由的DNA末端释放了闭合分子施加的扭转应力，从而促进侵入的RNA与其单链DNA模板的纠缠（图4）。拓扑异构酶I（Topo I）需要放松RNA聚合酶在转录期间产生的DNA超螺旋。它被camptothecin（CPT）高度特异性地抑制，生成一个Topo I-DNA切割复合体（Top1cc），在这个复合体中，ssDNA断裂持续存在，其30端与Topo I共价结合。已经有几项研究显示CPT处理刺激DNA-RNA杂交体形成（Groh et al.，2014；Marinello et al.，2013；Sordet et al.，2009）。对分裂后的初级神经元和淋巴细胞的分析表明，通过抑制转录或过度表达RNase H1，都可以限制共转录的R环，从而减少CPT诱导的DDR焦点。这可以解释为Topo I的失活阻滞了转录，促进了R环的形成，这会导致DSBs，或者反过来，如果来自Top1cc的破裂DNA促进了R环的形成（Sordet et al.，2009）。支持第一种可能性的是，CPT触发了在活动的发散CpG岛启动子处特异性积累的反义链RNAPII转录本，导致在启动子处的RNAPII暂时停滞和在包括rDNA的高度转录区域的R环的增加（Marinello et al.，2013）。同样，对内源的FXN和FMR1基因的分析，这些基因在Friedreich共济失调（FRDA）和Fragile X综合症中被改变，显示在导致基因沉默的CGG重复上积累了R环（Colak et al.，2014；Groh et al.，2014）。重要的是，用CPT处理导致在FXN产生了更多的这样的R环，导致了强烈的转录沉默（Groh et al.，2014）。总的来说，这些数据加强了这样的观点，即在积极转录的区域，DNA切割有利于R环的形成。

一个正在浮现的问题是在DNA断裂处的DNA-RNA杂交体是否可能对其修复产生影响。有几份报告提出R环可能介导DSB修复。已经显示出S. pombe RNase H缺陷细胞对产生DSBs的致基因变异剂敏感，而RNase H过表达则延迟了人为通过内切酶产生的DSBs的修复。此外，观察到在这些DSBs中，DNA-RNA杂交体的积累，RNAPII的水平更高（Ohle et al.，2016）。总的来说，这些数据表明，有效的DSB修复需要在切割的DSBs处的转录后，通过DNA-RNA杂交体的形成和随后的RNase H去除。然而，积极的ChIP信号可能来自de novo蛋白质招募或者在分析的位点上一个已存在的蛋白质的积累；因此，在断裂处的RNAPII的主要占有也可能来自于在经历断裂的DNA区域的一个延长的RNAP可能的停滞。另一方面，另一项研究显示，S. pombe RNase H双突变株既没有DSB修复的缺陷，也没有在MAT程序化DSB处的R环的富集。这种RNase H双突变对电离辐射-DSB修复和对CPT处理的生存是熟练的，并且并没有在MAT位点上通过DRIP分析显示出R环的积累，与其他区域相反（Zhao et al.，2018）。因为RNase H1和RNase H2在复制过程中去除Okazaki片段的RNA引物或插入到DNA中的核糖核苷酸，对特定的致基因变异剂的敏感性也可能是由于对复制或修复的间接影响。

涉及同源重组(HR)的人类因子如RAD52, RAD51, BRCA1, 和BRCA2在DSBs处的积累，已被证明在活跃转录区域通过RNase H过表达或者通过特殊的报告系统被减少（D’Alessandro等人，2018; Yasuhara等人，2018）。然而，对在活体人类细胞中由AsiSI限制内切酶引发的DSBs的RAD51积累的全基因组分析揭示了，HR因子主要富集在位于转录活跃染色质的DSBs（Aymard等人，2014）。这是否被R环的存在所增强尚未确定。然而，最近已经表明转录抑制剂DRB在IR暴露后减少了RPA和Rad51焦点。对此反应至关重要的是Rad52，其在过表达RNase H的细胞中对激光追踪的DSBs的招募减少；支持这一点的是，这种IR轨迹上的DNA-RNA杂交体检测在RAD52 KO细胞中增加（Yasuhara等人，2018）。这些结果暗示了DNA-RNA杂交体在活跃转录区域可能通过HR指导DSB修复。然而，缺乏杂交体增强HR的证据。可能的是，HR因子是必要的，以去除杂交体以允许DSB修复。实际上，由于HR的第一步是50端的切割，因此该链上的杂交体将保护这个端不被切割，而在30端的杂交体可能会促进50端的切割，但会损害30端单链DNA入侵同源DNA并通过HR启动DSB修复的能力（Aguilera和Go ́mez-Gonza ́lez，2017）（图4B）。

与杂交体会干扰HR的想法一致，基于AsiSI表达引起全基因组DSBs的DSB诱导系统的人类细胞的DNA-RNA杂交体的全基因组映射，显示出在DSB-侧翼染色质上有显著的R环富集。有趣的是，发现SETX被招募到这样的DSB末端。此外，SETX耗竭损害了RAD51的招募，并有利于53BP1的积累，这是NHEJ中的关键DDR因子(Cohen et al., 2018)。这些数据表明，DNA-RNA杂交体可能有利于HR因子的积累，以可能地促进杂交体的消除，使HR能够发生，可能在转录基因内的DSBs中抵消NHEJ。在DSB后形成的DNA-RNA杂交体是否能够促进DNA末端切割作为HR修复的第一步，尚不清楚。然而，DNA-RNA杂交体可能是需要被移除以允许修复的结构。实际上，许多报告支持一种模型，即DNA-RNA杂交体将干扰DSB修复而不是增强它。因此，在酵母中的RNase H双突变体中，Top1的缺失导致由于在重复的rDNA位点内发生的破裂诱导复制(BIR)缺陷而增加了致死性(Amon and Koshland, 2016)，并且持续的R环阻碍了DSB的切割，从而阻止了正确的修复，这是从酵母三突变体在RNase H1, RNase H2, 和Sen1的分析中得出的建议(Costantino and Koshland, 2018)。同样，在哺乳动物细胞中，AQR的消耗导致了HR蛋白如CtIP的DNA损伤诱导招募减少(Sakasai et al., 2017)。相反，最近已经显示出在DSB切割中起作用的人类CtIP/酵母Sae2也在酵母和人类细胞中预防R环中有作用。尽管研究提出CtIP/Sae2在切割R环上的内切核酸酶角色，不管它们在DSB末端切割上的已知功能(Makharashvili et al., 2018)，看看CtIP在DSBs上的杂交体上的作用是否更突出将是有趣的。实际上，我们不能排除BRCA2和其他可能的DSB修复因子在保护R环中的角色部分是修复缺陷细胞中未修复的DSBs积累的杂交体的结果的可能性。最近观察到ATM/CHK2 DSB信号通路的消耗导致R环的积累将与这个可能性一致(Barroso et al., 2019)。

总的来说，尽管很明显单链DNA和双链DNA破裂都有利于R环的形成，但仍需要大量的研究才能知道杂交体只是发生在进行转录的DNA破裂的次要结果，还是在修复中起功能的中间体。

R Loops与疾病

DNA-RNA杂交体的过量在许多综合症、人类神经系统疾病和癌细胞中都有记录（Perego et al., 2019; Richard and Manley, 2017）。后者可能并不令人惊讶，因为R环会导致基因组不稳定和复制应激，这是肿瘤细胞的标志（Halazonetis et al., 2008）。除了涉及BRCA1和BRCA2肿瘤抑制基因以及FA因子在预防R环形成方面的作用，最近对癌症相关的基因组看护者的筛查揭示了先前已被证明参与预防R环形成的mRNA生物合成的组分（Teloni et al., 2019）。关于这点，对人乳腺癌细胞系的分析表明，易位位于由雌激素信号诱导的基因内，而且R环在这些雌激素诱导的基因中积累（Stork et al., 2016），这暗示DNA损伤可能由活跃基因中的R环介导。卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）引发基因组不稳定的机制为支持，KSHV ORF57蛋白对THO复合体的隔离导致依赖R环的DNA损伤和基因组不稳定（Jackson et al., 2014）。另外，关于癌症，一个特别相关的最近的观察是，在Ewing肉瘤中，EWS-FLI1融合的表达增强了转录，导致R环的积累，同时通过与BRCA1相互作用，破坏HR，从而引起癌细胞中发现的基因组不稳定（Gorthi et al., 2018）。因此，将R环作为肿瘤发生过程中的驱动力是很有吸引力的，无论是作为复制应激的来源，还是通过阻止DNA修复途径的正常活动；然而，目前还没有直接的证据支持这一点。

R环也与可能影响基因组完整性的自身免疫性疾病有关，其影响方式可能是通过影响DNA复制和/或修复。Wiskott-Aldrich综合症（WAS）即为一例，该症患者在儿童时期患白血病的几率很高。最近的研究表明，WAS蛋白，WASp，的缺乏会导致R环的积累，特定基因的剪接缺陷，以及T辅助淋巴细胞中的R环介导的双链断裂（Sarkar等人，2018）。有趣的是，WASp这一细胞质蛋白进入核内，并与肌动蛋白核化的ARP2/3复合物一起被招募到受损的染色质上，该染色质正在通过同源重组修复双链断裂（Schrank等人，2018），这引发了一个问题，即R环的增加是优先发生在双链断裂的地方，还是在复制应激的地方。

Aicardi-Goutieres综合症（AGS）也被描述为与R环有关。人RNase H2的三个亚基中的任何一个的突变都与AGS有关，研究已经表明，在病人细胞的基因组中，R环会积累（Lim等人，2015）。有趣的是，AGS也与dNTPase SAMHD1的突变有关，这是一种被证明在停滞的复制叉（RF）处促进单链DNA降解的蛋白质，这是复制重新启动所需的步骤（Coquel等人，2018）。我们需要进一步的研究来了解是否是RER缺陷，还是杂交体积累是这种综合症背后的主要原因。

最后，许多可能与R环积累相关的疾病是神经退行性疾病。与癌症和先前讨论的综合症的关键区别在于，神经退行性疾病影响的是非分裂的神经元细胞；因此，在神经元细胞中积累的R环不会影响DNA的复制。重复扩展是几种神经退行性疾病的核心，包括共济失调症，肌萎缩性侧索硬化症，和核苷酸扩展疾病。在弗雷德里希共济失调症患者的细胞系中，携带GAA重复扩展的细胞系中，R环在这些三核苷酸重复的地方形成，并触发与疾病相关的基因的转录沉默（Groh等人，2014）。有趣的是，将反义寡核苷酸和双链RNA引入弗雷德里希共济失调症细胞系以识别扩展的GAA重复，通过阻止R环的形成来恢复表达水平（Li等人，2016b）。这可能是因为反义RNA与R环的RNA结合，破坏杂交体，或者沉默机制是解决R环的另一个机制。

另一方面，有人提出R环通过BIR促进重复扩展，这导致人们猜测R环可能是这种扩展的起源（Neil等人，2018）。在神经性疾病的情况下，我们不能忘记SETX，其突变与眼动不协调共济失调2型（AOA2）和肌萎缩性侧索硬化症4型（ALS4）有关，尽管人们还不清楚SETX突变如何在人类中引起神经退行性疾病。AOA2细胞的神经元基因表达改变，如全基因组研究所确定的那样，和R环水平增加（Becherel等人，2015）。此外，肌萎缩性侧索硬化症（ALS）已经与突变导致在运动神经元中R环积累的基因相关联（Perego等人，2019）。然而，最近描述了SETX的功能增强突变，该突变在ALS4患者中显示出R环形成的减少，这意味着DNA-RNA杂交体的高水平并不总是与疾病相关（Grunseich等人，2018）。两种已知有遗传基础的自闭症谱系障碍也显示出类似的情况。普拉德-威利综合症（PWS）和安吉尔曼综合症（AS）是由母体等位基因的泛素蛋白连接酶E3A（UBE3A）的缺失或突变引起的。在神经元中，UBE3A的父体等位基因是完整的，但由于转录继续通过convergent Snord116基因产生反义Ube3a转录本（Ub3a-ATS），因此它被表观遗传地沉默。使用拓扑异构酶I抑制剂topotecan稳定Snord116位点内GC富集的重复内含子段中的R环，导致染色质解缩并阻止Ube3a-ATS的转录，从而避免Ube3a的沉默（Powell等人，2013）。因此，尽管R环依赖的基因组不稳定性似乎是神经系统疾病的一个常见特征，神经性疾病和R环之间的关联可能并不一定反映因果关系，而可能只是由特定突变引起的转录缺陷的一个副作用。

总结与展望

在过去的二十年里，越来越多的证据表明，DNA-RNA杂交体存在于细胞的整个基因组中，并在许多受调控的细胞过程中发挥特定的功能，但在大多数情况下，它们构成了DNA损伤和基因组不稳定性的来源。DNA-RNA杂交体存在于蛋白质编码基因、tRNA、rRNA和非编码RNA中，它们对基因组功能和完整性有着重要的影响。三种不同类型的因子保护基因组免受非计划或病理性R环积累的影响：（i）防止它们形成的因子，大多数情况下是RNA结合和处理因子以及染色质重塑因子；（ii）解决它们的因子，如核糖核酸酶和DNA-RNA解旋蛋白；和（iii）在修复或复制过程中直接或间接帮助去除R环的DNA修复因子。越来越多的因子在R环稳态中的作用的识别，与这些在基因组中无处不在的结构的重要性以及它们对细胞增殖和生理功能的潜在影响一致。然而，关于这些因子在R环稳态中的作用，仍有许多问题尚待解答。

因此，我们对正常细胞中DNA-RNA杂交体的分布了解很多，但我们并不确切知道：（i）R环在基因组中的大小和频率；（ii）什么区分了生理R环和病理R环；（iii）R环在细胞周期的不同阶段的积累和影响；（iv）为什么有这么多非冗余的RNA解旋酶，它们在体外有DNA-RNA解旋活性，能保护基因组免受R环的积累；（v）R环如何影响转录-复制冲突，反之亦然；（vi）DNA断裂处的杂交体是由新合成的RNA形成的，还是由先前在延长期间参与的RNA聚合酶产生的新生RNA形成的；或者（vii）DNA-RNA杂交体在DSB修复中是否有任何作用。

目前的研究指向一个场景，即R环代表着与基因组压力和功能障碍相关的标记。正如任何与基因组压力相关的条件都可以通过积累DNA断裂、复制叉停滞或有丝分裂错分，等其他特征来识别，我们开始意识到它们也可以通过R环的积累来识别。高R环水平可能只是细胞（核）压力的一个签名，因此，越来越多的与复制、修复、转录、RNA处理、RNA输出、染色质重塑相关的因子的识别，它们的缺失伴随着R环的积累，可能并没有识别出R环稳态的直接调控者。尽管非计划的R环与基因组不稳定性和复制压力相关，这些是癌症和许多遗传性疾病的特征，并且多种神经退行性疾病与R环的积累相关，我们尚未建立R环与疾病之间的因果关系。因此，理解R环稳态的分子基础，以及保护细胞免受非计划R环的机制，对于理解R环作为转录隐藏面的作用是必需的。

文章来源：doi.org/10.1016/j.cell.2019.08.055