【Cell】有关生物大分子凝聚体以及液液相分离的知识汇总（四）

凝聚物的物理属性分析

生物凝聚物的物质状态各异

显然，细胞内凝聚物的物质性质可以有很大的变化。这些结构可以在连续体上呈现出高度流动和液态，也可以更粘稠、粘弹性或多孔固体或凝胶。这些变化的物质状态可能是由于凝聚过程中涉及的特定分子组分，以及液滴的时间和成熟度以及淬灭深度，即系统在两相范围内的深度所导致的。RNA的存在—无论是特定的还是非特定序列—都可以影响液滴的物质性质；然而，RNA是使液滴流动化还是固化，这取决于具体的条件和环境，可能是由于价态和静电效应的贡献。在几个环境中，已经证明，随着时间的推移，或者在促进稳定蛋白质相互作用的突变或阻止蛋白质与RNA结合的能力的突变下，液滴变得更像固体。此外，在更像凝胶的状态下，固态是否可逆是需要考虑的一个重要特性，因为不可逆性对生理学和病理学的可能影响非常重要。尽管关于可以在重组系统中检测到的物理状态的描述越来越多，但某一特定物质状态在细胞中的实际功能仍然不清楚。特定的粘度或粘弹性在进化过程中被选择的程度，或者是凝聚成分的紧急性质，并不一定为结构的功能调整，这还不清楚。因此，仍然很重要的是要表征和操纵液态或凝胶状的隔室的物质状态，最终的目标是理解物质状态与功能是否以及如何相关。

监测凝聚物的物理属性

体外

在体外重组LLPS的实验设置中，有多种选择可以测量液滴的物质状态（图3）。最直接的测定体外物质状态的实验是测量逆毛细管速度，它是粘度与表面张力的比率。这个比率可以通过使用荧光或透射光显微镜拍摄融合的液滴，并测量两个液滴完全融合为一个液滴的时间，来估计不同大小的液滴。将逆毛细管速度的测量与被动微流变学结合，其中可以直接计算粘度，可以推断出液滴的表面张力。测量接触角（盖玻璃与液滴表面之间的角度）也可以提供有关表面张力和液滴表面化学性质的重要信息。

被动微流变学涉及在液滴内嵌入珠子，并通过确定珠子的平均平方位移（MSD）来监测它们的扩散性。微流变学有许多需要考虑的因素，包括珠子的材料和大小，珠子表面的钝化，需要稳定的显微镜设置以最小化漂移，以及向液滴添加珠子和确保分析的珠子在液滴的中心区域，以避免边界效应的行为。已经实施了一种基于微流体的方法，它通过在流动下形成只有两个明显的液相（通过融合所有液滴），帮助嵌入珠子和避免边界效应，这有助于避免一些常见的人为因素，并促进示踪珠子嵌入密相。调查各种大小的珠子的行为可以帮助确定物质何时、何处可能表现出弹性性质。理想情况下，这些测量应用于简单的液体，但并不总是知道凝聚物是否是纯粹的简单液体，或者它们是否有结构异质性。如果结构表现为高粘度液体或凝胶，原子力显微镜（AFM）或光镊可能是进一步测量材料刚度的相关方法。通过结合AFM和红外纳米光谱（IR），可以接近组成蛋白质的二级和三级结构和组装形态的关系。对微流变学的解释相关的是估计液滴中聚合物网格的孔径大小。这可以通过使用不同大小的荧光标记的dextran和确定嵌入的阈值来完成，注意要避免可能由于探针与液滴组分之间的相互作用产生的人为因素。

荧光粹灭后光恢复（FRAP）实验通常也对液滴进行，以评估其流动性，而不同的成分在恢复速率上可能因为不同的移动性而大大不同。这种差异在比较蛋白质和RNA时尤其明显，其中后者相对较不活动。虽然FRAP是一种高度可获取的技术，但在分析FRAP数据时存在各种限制和挑战。人们常犯的一个错误是假设全FRAP的恢复速率仅反映稀薄相和浓相之间的交换率。然而，FRAP恢复速率也依赖于其他参数，如光照液滴的大小、液滴内的移动性和漂白区域的大小，而这些通常并未考虑在内。然而，它仍然可以用于评估物质状态的极端或者物质状态随时间的变化。如果结构足够大，除全FRAP外，也可以进行半FRAP。在半FRAP中，从漂白区域到未漂白区域的荧光重排提供了关于在给定结构内分子内部移动性的更直接信息。重要的是，FRAP也可以用于评估液滴是否在空间上是均匀的，基于恢复模式。如下所述，FRAP不应被视为确定LLPS是否是结构组装机制的决定性诊断。

为了在单个分子的尺度上更准确地估计扩散性，可以在组分可以稀疏标记并且足够移动以被检测的情况下使用荧光相关光谱（FCS）。FCS的变化也已被用来评估液滴有多稀薄，这可能是一个有用的参数，如果正在开发理论模型，并准确评估浓度。此外，应用偏振荧光显微镜可能有助于检测可能与液态相共存，但可能无法从整体荧光中检测到的纤维状或固态结构的各向异性子区域。

（未完待续）

文章来源：https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.12.035