【Cell】有关生物大分子凝聚体以及液液相分离的知识汇总（五）

活细胞中确定和分析表现出LLPS的凝聚物

该领域的一个主要挑战是拥有准确的指标，以确定一个特定的蛋白质或结构在细胞环境中确实是一个相分离的体。在某些条件下，当处于足够的浓度和/或人工缓冲条件时，许多蛋白质和RNA都能进行体外LLPS。此外，常见的情况是过度表达一个蛋白质，看到一个大的、球形的滴，并推断内源性表达的蛋白质也必须在较低的浓度下形成类似液体的滴，只是这些滴的大小低于光学显微镜的检测限制。然而，由于相分离需要越过一个饱和浓度，因此在解释过度表达数据时应谨慎。应该尽量找到除过度表达之外的其他指标，以支持一个区室确实是相分离的，而不仅仅是一个宏观的点状结构。

目前，定义相分离结构的常见标准是它是球形的，能够融合，并且能从光漂白后恢复。虽然几何形状和融合能力支持了液态，但重要的是要记住，从FRAP恢复的速率有许多不同的解释，尤其是在对内源性蛋白质进行活细胞成像的约束条件下，结构可能很小并且在空间中移动。快速的FRAP可以出于各种原因，包括蛋白质与多孔的、固态结构的可逆绑定。类似地，使用1,6-己二醇的处理，已经作为一个指示LLPS的指标，也有注意事项。使用己二醇来确定装配体的物质性质的依据来自于一个研究，该研究中FG-核孔蛋白胶形成的选择性屏障被破坏。虽然己二醇可以干扰许多IDR的LLPS，但这既不是必要的也不是充分的，因为相分离涉及各种类型的相互作用，包括pi/pi、阳离子/pi和静电相互作用，这些并不都对己二醇敏感。当用在活细胞上时，也应谨慎使用己二醇，因为它改变了膜的通透性，因此可能导致额外的伪象。快速FRAP恢复和对己二醇的敏感性不足以明确证明一个结构是通过LLPS形成的。

哪些是更进一步刻画结构为相分离产物的可靠指标呢？

一个好的方法是尝试在活细胞中复制相图，显示出组装的浓度依赖性阈值，即Csat。在细胞中绘制相图需要变化表达的蛋白质水平，通常超过内源性水平。尽管具有挑战性，测量到的Csat可以直接与给定条件下蛋白质在细胞中的浓度进行比较，揭示相分离是否可以发生。一个注意事项是，可能无法用简单的方法检测到衍射限制的装配体，可能需要使用超分辨显微镜。然而，目前还不清楚结构需要达到什么大小才能被认为是相分离的。

在许多情境下，LLPS是由蛋白质-蛋白质或蛋白质-RNA复合物中的多价相互作用驱动的，已经确定的是，价性的改变可以改变相分离物质的性质。因此，增加和减少价性的基因操作应该会影响相分离的可量化方面，如浓度阈值，但也可能影响滴的位置、大小或物质状态。生成嵌合蛋白也可能有用，其中被认为驱动相分离的序列，如IDRs，被其他能够组装的序列所替代，以评估功能是否可以被恢复。这样的序列可以是已知能够寡聚化的蛋白质域，比如muNS病毒的自组装矩阵蛋白。最近，已经开发出光遗传学工具，通过控制多价性的改变在局部诱导凝聚，而在某些情况下，这可以是一个有用的工具。有几种光遗传学系统可用，它们利用工程化的多价性驱动细胞特定区域的相分离。这样的系统对于研究无膜区室在活细胞中的成核非常有用，特别是如果诱导相分离与表型功能有关，并且工具可以调整以复制生理蛋白质浓度。然而，因为当前的光遗传学工具在自然演化的多价性之上强加了人为的多价性，结果应该谨慎解释，并且理想情况下应该与其他实验相结合。

在体内凝聚物的物理性质探测

在细胞中评估物质属性的能力相对有限。然而，当体内滴足够大时，通过捕捉融合滴的弛豫行为的时间延迟显微镜可以确定反向毛细管速度。即使没有确定绝对粘度，这种方法也有助于比较不同滴的属性。FRAP也可能被使用，但如前所警告的，恢复有很多解释，这个测量并不能确定性的证明液态，这个液态是通过LLPS过程产生的。

我们迫切需要未来的工作，形式为可以在体内使用的探针，以评估细胞环境中凝聚物的粘度和孔隙度。最近显示，基因编码的纳米颗粒（GEMS）是细胞质微流变学的有效探针，未来将这些颗粒定位到凝聚物的工作可能会使它们作为被动微流变学探针。使用热诱导的细胞内流动，使GEMS适应活动微流变学也似乎是可行的。此外，针对特定凝聚物的对拥挤敏感的FRET探针也可能是一个有用的工具，以监测滴的密度。

展望未来，定量相位显微镜可以评估滴表面折射指数的变化，这应该根据结构的物质状态而变化。如果在界面存在足够的差异，甚至可能使用光镊来操纵和测量活细胞环境中结构的物质属性。最后，确定凝聚物密度的新方法，如折射指数层析术和更先进的成像技术如Brillouin显微镜有很大的希望，可以无损地在活细胞内映射凝聚物的物质属性。

除了探测体内凝聚物的物理性质外，还需要关注这些特定性质对功能的影响（见下文）。因此，最理想的方法是进行能够在某种程度上改变假定的凝聚物的物理特性并影响其功能的操作。然而，这并非易事，因为会影响蛋白质结构的遗传扰动可能会直接影响功能，而不仅仅是由于凝聚物的改变而导致的。

作为指导理论的聚合物化学的实用性和限制

借助于LLPS在生物学中广泛应用的洞察，该领域的一个目标是从描述单个蛋白质的相行为，进展到能够解释和预测大分子的相行为的一般框架。在理想情况下，可以通过序列预测凝聚相的饱和浓度、刺激响应性和物质特性。虽然我们离达到这个目标还有很长的路要走，但我们可以利用相分离理论的认识，并将其扩展应用于复杂生物聚合物混合物。集成理论的一个重要长期目标是解析控制相分离特定特征和驱动力的机制。模拟提供了实验上难以获得的分子相互作用细节的见解。实验与理论和模拟的结合将变得更加重要，因为我们正在重新构建更复杂的生物分子混合物，以更好地代表细胞内凝聚物的实际分子多样性。

有几个理论框架对于描述相分离和从实验数据中推导出结论是有用的。Flory-Huggins理论描述了在溶剂质量较差的条件下同源聚合物从溶液中热力学驱动的分离，这将促进聚合物-聚合物的相互作用。该理论已被应用于从实验数据中预测相分离的临界点，并为我们认识到溶剂条件对LLPS的影响提供了见解。Overbeek和Voorn对Flory-Huggins理论的扩展明确考虑了电荷效应，这是描述异性带电聚合物之间复杂共聚的必要条件。这两种理论都是平均场理论，最适合描述同源聚合物，不考虑显式的序列依赖效应或聚合物的波动性。最近发展的随机相近似明确考虑到带电残基序列模式，并成功地用于模拟DDX4实验数据。采用显式序列考虑的理论发展从同源聚合物的观点转变，允许评估异源聚合物是否符合同源聚合物的行为。虽然某些蛋白质的相行为可以很好地用平均场同源聚合物理论描述，但新出现的数据表明，其他蛋白质序列编码的稠密相特性无法通过同源聚合物实现。例如，LAF-1 RGG结构域的相行为通过使用超快速FCS检测到的半稀释稠相，需要理论描述来考虑三体相互作用和蛋白质聚合物的大尺度构象波动。远离平均场理论，考虑到波动性的作用，也许是捕捉临界点附近的相行为所需的。

另一种深入了解相行为的途径是使用模拟方法。即使对于无序蛋白质，也可以对单个蛋白质进行模拟，并成功地推导出其序列/功能关系的见解。足够大以进行相分离的系统通常包含数百到数千个分子，并需要将系统以简化的方式表示，并且只对一部分相互作用进行建模。粗粒化的模型参数化是粗粒化的主要挑战，以实现对可访问实验行为的准确再现。最近描述的平板抽样方法可用于直接提取无序蛋白质的热力学相图，并且对于具有详细序列信息的聚合物模拟具有很大的潜力。

粗粒化模拟多组分系统最近提供了对形成多层无膜细胞器（如核仁和核小体）的物理原理的见解。模拟支持了不同蛋白质之间或蛋白质与RNA之间序列编码相互作用的相互作用，这在多达五个组分的情况下是可能的，这显示了这种模拟系统地探索多组分系统中相互作用的能力。模拟和理论是实验表征相分离的重要补充方法。反过来，对细胞中相行为的表征将为精确参数化模拟方法和新兴的新理论提供丰富的数据，这些理论描述了具有迄今在简单的合成聚合物体系中尚未观察到的性质的复杂生物分子混合物的相行为。

（未完待续）

文章来源：https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.12.035