【Cell】有关生物大分子凝聚体以及液液相分离的知识汇总（六）

如何确定生物大分子凝聚体功能？

迄今为止，许多蛋白质已被证明在理想条件下在体外发生相分离。经常情况下，同样的蛋白质在活细胞中也会形成聚集体，特别是当这些蛋白质被过度表达时。然而，一个给定蛋白质在高浓度下形成聚集体并不一定证明该蛋白质的相分离能力在功能上是相关的。要证明这一点，需要仔细设计实验来调控蛋白质的相分离，同时不改变其其他功能或特性。这样的实验基础可以是体外相分离分析。在序列分析的指导下，可以通过引入突变来改变蛋白质的相分离特性。然而，突变相分离蛋白质可能不像结构化蛋白质那样简单。例如，为了改变低复杂度蛋白质的相行为，可能需要引入多个突变来显著改变蛋白质的多价性。一旦确定了具有特定相分离缺陷的变异体，可以将其引入细胞中以替代野生型蛋白质。然后可以测试这些细胞系在生理条件下或在受到干扰时促进无膜细胞区域形成的能力。理想情况下，这些实验应与功能测定结合起来，以确定LLPS缺陷是否与蛋白质功能缺陷相伴而行。

这类遗传实验存在的一个问题是观察到效应的时间尺度。表达变异体蛋白所观察到的表型可能不一定是由于相分离行为的改变，而可能是由于间接效应造成的。例如，可以想象表达变异体可能导致应激反应，而这可能会间接影响活细胞中凝聚物的形成。解决这个问题的方法之一是直接将荧光标记的蛋白质注入活细胞中。利用荧光时相显微镜观察蛋白质相分离的实时过程。此类实验已成功用于研究核中RNA调控类似朊病蛋白的相行为的作用。如上所述，光遗传学提供了另一种在活细胞中操纵相分离的方法。

研究相分离的功能效应的另一个可能性是使用细胞提取物。使用提取物进行实验在帮助我们理解翻译和转录等基本细胞过程方面非常重要。提取物实验的优势在于可以进行体外重构生物化学实验。例如，可以将RNA结合蛋白体外组装成凝聚体，然后测试凝聚体形成对蛋白质活性的影响，比如体外翻译实验，或将转录机制与体外转录实验相结合。这类实验可以在体外和体内之间建立重要的桥梁。

LLPS的物理化学特性提供了细胞中相分离过程的多种可能功能。在接下来的内容中，我们提供了相分离可能的功能剖析的多种例子。然而，对于所有这些功能，仍然需要获得更多的证据，有很大的需要识别出相分离的全部功能后果（图4）。

1. LLPS可以用于感知和快速、适应性和可逆性的响应。

溶液条件的微小变化会导致快速而明确（即无限协同）的凝聚，这种生物物理响应比转录或翻译程序的启动更快。已经证明LLPS可以用于对热或pH应激的适应性响应。

2. LLPS可以用于缓冲蛋白质的浓度。

增加大分子的浓度会导致超过饱和浓度的凝聚。进一步增加浓度会导致高密度相的体积分数增加（保持高密度相浓度不变），稀释相的体积分数减小；即稀释相中的浓度保持不变。而其他的自组装过程（如蛋白质寡聚化）通常不会产生这种缓冲行为。在细胞中，过量的蛋白质可以储存在无膜小器官中，并在蛋白质水平下降时根据需要进入稀释相中。

3. LLPS可以在凝聚体中局部浓缩分子以激活反应、信号传导过程和细胞骨架结构的核聚。

在凝聚体中增加关键酶或蛋白复合物的局部浓度可以加速生化反应。例如，当miRISC复合物发生相分离时，其解帽活性增强，并且由信号适配体在膜上形成的T细胞受体聚集更有效地启动肌动蛋白聚合。类似地，中心粒成分将微管聚集以促进微管的核聚和生长。最后，回到最早被发现的无膜小器官之一，有越来越多的证据表明核仁的液态状态对核糖体的组装可能是重要的。

4. LLPS可以隔离分子以阻止反应或使其失活。

如果一个关键组分被招募到高密度相中，而其他所有组分用于酶催化反应或信号事件的仍在稀释相中，那么该反应或信号事件将受到抑制或减慢。

5. LLPS可以介导蛋白质定位到预先存在的相分离的非膜小器官中。

生物分子凝聚体显示出选择性特性，允许某些蛋白质和RNA进入，排除其他分子。尽管RNA和蛋白质的序列特征和相对表面张力可能在分子排序到不同的共存凝聚体中起作用，但其规则仍然不清楚。越来越明确的是，许多在无膜小器官中发现的蛋白质能够在接近生理条件下发生LLPS，即使它们不是细胞中形成小器官所严格要求的。因此，相分离可能介导分子定位到预先存在的小器官中，正如最近针对UBQLN2和SPOP提出的。

6. LLPS可以导致具有特定粘弹性特性的材料的形成，而凝聚过程可以用来完成工作。例如，凝聚可以产生塑形细胞结构（如膜）的机械力。这样的机制可能对形态发生非常重要。

7. LLPS可以导致形成具有特定物理化学和力学过滤器的材料，其孔径由构成凝聚物的大分子之间的交联数和动力学决定。这已经在核孔中得到证明。

尽管在生物学中，凝聚体的可能作用数不胜数，令人兴奋，但确定其功能角色并非易事。对于上述每一种功能类别（以及可能尚未发现或想象的其他功能），都需要设计量身定制的实验来确定凝聚体的贡献。有些需要基因操纵价态，而另一些则需要在体外和体内对凝聚体的物质特性进行细致的表征。我们现在手头上有越来越多的工具和方法，可以揭示凝聚体在特定细胞环境中的功能。

最后，在开发实验工具的同时，我们需要更好地从后基因组时代的大量自然序列变异中提取有关功能相分离的信息。自然已经进行了许多实验，使蛋白质的相行为适应了活细胞中的功能约束。我们需要创新的工具来解读这些信息，识别相分离的关键特征和选择压力。目前，由于相分离蛋白质的序列很难对齐，这样的分析非常困难。新的序列对齐方法和基于序列协变的进化耦合的创新计算方法，适用于无序序列，将使我们更接近实现这一目标。

（完）

文章来源：https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.12.035