【Cell】万字综述：临床转化前药物发现的疾病模型（活体模型使用指南，建议收藏！）

摘要

尽管科学界取得了许多进展，转移性疾病仍然基本上是不可治愈的。因此，科研人员迫切需要更好地理解促进转移、驱动肿瘤进化以及导致先天和获得性药物抗性的机制。为了实现这一目标，人们认为复杂的肿瘤生态系统可以通过精细的转化前模型来再现。文章首先介绍了同基因和患者来源的小鼠模型，这些模型是大多数转化前研究的基础。接着，文章展示了鱼和果蝇模型的一些独特优势。之后，他们考虑了3D培养模型在解决剩余知识差距方面的优势。最后，文章提供了关于多重技术的小插图，以深化对转移性疾病的理解。

引言

在生物体的生命周期中，累积的遗传、环境和表观遗传修改可能导致正常组织恶性转化为肿瘤。这些肿瘤可以被比喻为恶性细胞的动态生态系统，这些细胞浸泡在细胞外基质中的居民和招募的免疫和基质细胞的环境中。这种复杂性的认识在我们设计转化前模型来模拟器官特异性疾病时起到了变革性的作用。此外，治疗方法不再仅仅集中于肿瘤细胞中的遗传驱动突变，还集中于器官微环境，特别是免疫部分。使用转化前模型结合患者筛查和定制治疗的创新，已经提高了局部疾病的患者生存率。然而，疾病的晚期：转移，仍然是癌症致死的主要原因，其中约90%的转移患者死于他们的疾病。疾病进展是由于多种因素。首先，肿瘤细胞的基因组和表型异质性是一个促成因素，其中原始肿瘤中存在的亚克隆或具有固有或获得性药物抗性的细胞可能驱动持续的生长和播种。第二个因素涉及播种远处部位的时机。在某些情况下，有人推测肿瘤细胞可能在检测和手术切除/治疗原发性肿瘤之前的几年内已经扩散，产生休眠的转移性微损伤，这些微损伤使用当前的成像技术是不可检测的。由于与动态环境的相互作用而产生的新表型是第三个因素。简单地说，转移部位的不同肿瘤细胞表型可能受到在播散过程中以及随后的器官特异性播种和转移性殖民过程中暴露于大量环境线索和应激因子的影响。因此，治疗方法可能显示出器官特异性的反应、减少的疗效或短暂的反应。所有这些特点都指向了更全面地模拟转移过程的需要，无论是在时间上还是在空间上，以更好地指导有效的药物开发。

在单细胞和空间基因组学、高维成像和流式细胞术的技术进步意味着可以直接从具有强烈相关生物学成分的临床研究中获得越来越丰富的信息。理想情况下，模型系统应该用于补充和增强我们从临床研究中学到的东西，反之，临床观察必须作为模型的现实检查。重要的是，模型系统允许我们建立因果关系，进行详细的机制分析，以及为治疗发现提供平台。许多与肿瘤发生机制、免疫系统功能和肿瘤-微环境相互作用相关的关键生物学原理首先在这些模型中得到了阐述。在这里，我们提供了主要的转化前癌症模型的概述，突出了最近产生的生物学见解和治疗发展和生物标志物发现的实用性。

所有模型都不是完美的，但它们的不完美方式各不相同

所有的模型都有其不足之处，但如果根据它们的特定优势来使用，它们都是有价值的。在这里，我们概述了用于癌症研究的模型，这些模型涵盖了一系列的复杂性和分辨率（图1A）。在部署这些模型时，选择最能捕捉到研究中最重要的生物学维度的模型系统是至关重要的，这个过程可能需要在其他轴上做出牺牲（图1B和1C）。例如，分析抗肿瘤免疫反应需要一个完整的免疫系统的模型。因此，我们的选择受限于具有完整免疫系统的全动物模型，这带来了相对较高的费用和相对较低的吞吐量。在干预研究中选择转移负担作为临床相关的终点，使得使用癌症患者的循环肿瘤细胞（CTCs）的最新移植模型的优势得到了突显。详细的分子机制分析和高通量药物和遗传筛选更适合在低等生物和3D培养系统中进行。不同模型类型的一些关键优势和劣势总结在表1中。更详细的讨论构成了我们综述的其余部分。

为什么使用小鼠？

在过去的几十年里，癌症治疗的焦点已经转向包括免疫疗法和抗血管生成疗法在内的策略，这些策略通过对肿瘤微环境进行重新编程来间接地针对肿瘤细胞，从而抵抗或逆转肿瘤的生长。重要的是，小鼠模型为我们提供了一个机会，比大多数简化模型更完整和“类人”的方式重建肿瘤生态系统的复杂性。小鼠模型提供的特殊机会包括以下参数：(1)从起始到转移的所有肿瘤发生阶段都有可能用于自然历史和干预研究，(2)肿瘤产生的复杂和不断演变的微环境通常与其人类对应物非常相似，(3)可以在整个肿瘤生态系统的背景下读出遗传或药物干预的效果，以及塑造它的局部和全身因素，(4)可以使用先进的成像技术动态地观察肿瘤进展。

小鼠建模已经从历史上依赖于致癌剂处理的小鼠肿瘤模型和移植到小鼠中的肿瘤细胞系扩展到包括一系列高度复杂的基因工程模型。基因组工程的进步使得我们可以以空间和时间上受控的方式修改或选择性地激活/失活基因，这一过程随着CRISPR/Cas技术的应用而增加了速度和精度。目标基因可以在肿瘤生态系统的任何部分进行调节，以揭示它们对肿瘤发生过程的贡献。我们在下面简要描述了不同类型的小鼠模型，而从这些模型中得到的选择性洞察在随后的部分中得到了强调。虽然我们关注的是小鼠，但应该注意，在某些情况下，大鼠可能更有优势。例如，虽然几乎所有的小鼠乳腺癌模型都是雌激素受体阴性的，但用致癌物N-亚硝基甲基脲处理大鼠会产生雌激素受体阳性的乳腺肿瘤。

多种类型的小鼠模型

原位模型

原位模型是指通过应用致癌物或通过基因工程引入致癌事件在小鼠体内原位启动的肿瘤。其主要优点包括从启动到转移进展的所有肿瘤发生阶段的实验访问，以及在完整的免疫系统背景下肿瘤和微环境的共同演变。复杂的多等位基因工程小鼠（GEM）模型可以被构建来近似人类疾病在驱动突变和组织病理学方面的特点。例如，在广泛使用的KPC模型中，小鼠胰腺导管腺癌（PDAC）中发现的KRas和p53的突变形式被有条件地在外分泌胰腺中表达。这些PDAC肿瘤高度的结缔组织化，并显示出人类疾病的特点，使得这种模型非常适合评估免疫疗法。

GEM衍生的移植模型

在原位模型中，肿瘤进展通常在长时间范围内和异步地发生，使它们对于治疗干预研究通常不太合适。为了规避这些问题，一种策略是使用GEM衍生的移植物（GDAs），其中GEM肿瘤的片段被植入到同种系免疫完整的受体小鼠中。已经为多种肿瘤类型生成了GDA库，其多样性足以使它们成为治疗测试和生物标志物发现的有用平台。

细胞系衍生的移植模型

小鼠肿瘤细胞系移植到同种系免疫完整的小鼠宿主中（细胞系衍生的同种移植：CellDAs）或人类肿瘤细胞系植入到免疫缺陷的小鼠宿主中（细胞系衍生的异种移植：CellDXs）代表了小鼠模型的现实性与可操作性之间的平衡。大型、同步的肿瘤患有动物队列可以为治疗干预研究生成，而且在体外对肿瘤细胞进行遗传操作的能力使这种模型对于遗传筛选具有优势。

患者衍生的异种移植模型

GEM模型通常只能再现最常见的致癌事件，而已建立的肿瘤细胞系由于在培养中经过广泛的选择而在其多样性上受到限制。患者衍生的异种移植模型（PDXs）为恢复这种异质性提供了一个平台。手术切除的人类肿瘤或肿瘤活检的片段被植入到免疫缺陷的小鼠中，并可以在体内扩增，保留了其原始的基因组和表型异质性。

循环肿瘤细胞衍生的异种移植模型

上述所有小鼠模型的一个局限性是它们通常具有低效的转移能力。在一个重要的改进中，也可以从癌症患者的循环肿瘤细胞（CTCs）建立PDXs。这种方法的一个关键优势是能够高效地生成转移模型。由于这种技术的潜在力量，它在“从CTCs衍生的模型”部分中被更详细地考虑。

小鼠模型揭示肿瘤进展的关键原理

从历史上看，小鼠模型在我们对肿瘤发生过程的基本理解中起到了非常重要的作用，包括识别致病因子如环境致癌物和病毒，识别和验证致癌驱动事件，建立肿瘤免疫编辑原理，识别癌症干细胞亚群作为肿瘤形成和药物耐受的细胞驱动器，以及探索转移的“种子和土壤”假说。在这里，我们将重点介绍小鼠建模中的一些强大技术，并强调这些方法的一些见解。

基因筛选建立体内功能

一般来说，小鼠模型不适合进行高通量基因筛选，这些筛选更适合在低等生物或三维（3D）培养系统中进行。然而，低复杂度的目标基因表达库或shRNA/sgRNA库可以用于快速功能筛选候选基因体内。使用一种名为PerturbMap的CRISPR驱动方法，研究者们在小鼠肺癌的同种移植模型中并行敲除了35个基因，并观察了每个基因敲除如何单独影响该克隆的肿瘤微环境。敲除肿瘤细胞中的TGFBR2导致肿瘤细胞的生长优势以及局部微环境中T细胞的排斥，从而证明了肿瘤基因型和基质表型之间的因果关系。

谱系追踪揭示细胞命运和轨迹

通过细胞条形码的谱系追踪涉及对单个细胞进行不可磨灭的标记，以便观察其后代的位置和命运。细胞可以用荧光蛋白标记并通过光学成像进行监测，或者可以用分子条形码标记并通过单细胞测序进行监测。图像标记是通过在体外转导肿瘤细胞或转基因地插入GEMs来引入的。体内标记通常涉及使用组织特异性或可调节的Cre重组酶在特定时间激活荧光蛋白转基因。"Confetti mouse"是这种方法的多色版本，它随机地用不同的颜色标记单个目标细胞。多色成像策略与其他技术结合使用，确定了Lgr5+干细胞作为肠道肿瘤的起源细胞，同时显示出转移性扩散是由Lgr5-细胞驱动的，在转移部位恢复Lgr5+干细胞样表型。

看见即是相信：从活体成像中获得的洞察

在上述方法中，细胞的轨迹和行为是从肿瘤进展的不同阶段的静态快照中推断出来的。多光子显微镜的活体成像技术的进步使得我们能够实时观察肿瘤细胞在其原生态中的动态特性，具有单细胞分辨率，并且可以持续数周。为许多小鼠器官开发了最小干扰的可植入光学窗口。细胞可以用荧光标记物持续或有条件地标记，或者它们可以表达动态的细胞状态的荧光传感器，而内源性荧光可以揭示关于特性的额外信息，如代谢状态和胶原组织。

这种方法允许在一系列时间尺度上观察动态事件，并为肿瘤细胞的可塑性、转移过程和药物耐受性提供了新的见解。通过对肿瘤细胞进行持续的活体成像，发现肿瘤细胞在转移过程中从原发肿瘤内进入血管，通过血管中的专门的微解剖“通道”（即“转移的肿瘤微环境”或TMEM）。使用活体中的动态荧光癌症干细胞传感器显示，与TMEM处或附近的巨噬细胞的直接接触可以诱导更分化的肿瘤细胞产生侵袭性的干细胞样表型，从而促进转移和药物耐受性。为了深入了解药物耐受的“持续细胞”的性质，结合谱系追踪和细胞休眠的动态报告者，用于显示细胞-基质相互作用诱导结肠癌干细胞的休眠和化学耐药性。

小鼠模型用于治疗药物的开发

对于治疗性药物的开发，小鼠模型总是受到其低通量的限制，使其不适合大规模的药物筛选。然而，它们非常适合证明药物靶点，验证在更简单的系统中进行的药物筛选的顶级命中，评估潜在的毒性，建立药物作用机制在完整的肿瘤生态系统中的背景，以及识别固有的或获得的治疗耐受性的机制。如果模型中建立了足够的异质性，这些模型也可以成为开发有用的预测生物标志物的强大平台。在这篇综述中，我们将特别关注它们在免疫治疗药物的开发中的应用。

免疫疗法：新的前沿

免疫疗法已经彻底改变了癌症治疗的格局。目前临床使用的两大类免疫疗法是免疫检查点阻断（ICB）和采用嵌合抗原受体（CAR）T细胞的采用性免疫疗法，尽管还有其他方法，如使用双特异性抗体促进免疫效应细胞和肿瘤细胞之间的相互作用，也显示出临床前景。在ICB中，治疗性抗体被用来阻断抑制性免疫检查点，并恢复更有效的抗肿瘤免疫，如针对CTLA4的抗体（例如2011年获得FDA批准的Ipilimumab）或PD1/PDL1轴，但现在已扩展到许多其他抑制性检查点。在CAR T细胞疗法中，患者自己的T细胞被收集并工程化，以表达一个识别肿瘤特异性抗原的CAR。

小鼠模型在免疫治疗开发中的优势

小鼠模型在测试免疫疗法和其他需要良好模拟复杂且互动的肿瘤生态系统的基质靶向疗法时表现得尤为出色。事实上，首次在肿瘤细胞移植模型中进行的临床前证明，显示阻断CTLA4可以驱动肿瘤排斥。对小鼠中特定免疫细胞亚群的选择性消除也有助于确定如幼稚的髓样细胞等抑制性免疫细胞在限制ICB反应中的作用。随着Cytometry by Time of Flight (CyTOF)成像、Co-detection by Indexing (CODEX)/Phenocycler成像以及单细胞和空间基因组学等高维度分析工具的应用，为临床和临床前使用提供了详细的描述，描述了发展中的肿瘤的变化免疫结构及其对治疗的反应。除了药物测试，临床前研究可以为临床观察提供机制细节。在对临床样本进行相关观察后，提出了肿瘤基质可能抑制ICB效能的观点，通过结合单细胞RNA测序和小鼠模型中的基因靶向细胞消除，确定了特定的非免疫基质细胞亚群，这些细胞特异性地妨碍了有效的抗肿瘤免疫的发展。这些信息可能被利用来使免疫疗法更加有效。

免疫检查点阻断

对于ICB药物，需要完整的免疫系统来看到效果，这需要使用同种免疫能力正常的小鼠-小鼠模型。这本身就带来了一些挑战。在实际操作中，如果免疫检查点目标在小鼠和人类之间没有很好的保守性，那么必须为临床前研究开发一个中和小鼠目标的替代啮齿动物抗体，这在开发临床试剂之前或与其同时进行。当目标表位在物种间保守时，可以直接在小鼠模型中测试人源化或完全人源化的ICB药物，但只能在小鼠抗人抗体反应变得限制性之前进行短期实验。

人类化小鼠免疫系统

测试ICB疗法所需的免疫能力正常的小鼠使得不能使用PDX面板，这些面板更丰富且更准确地代表了人类肿瘤的异质性。为了解决这个问题，尝试了各种策略来生成带有人类化免疫系统的小鼠。肿瘤细胞和来自同一患者的匹配免疫细胞可以通过使用外周血单个核细胞（PBMCs）或肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）作为免疫细胞的来源，移植到完全免疫缺陷的小鼠宿主中。然而，与PBMCs或TILs的再生导致在4-8周内出现致命的移植物对宿主疾病（GvHD），限制了对早期事件的观察期。

增加小鼠模型的转化相关性

尽管有一些值得注意的成功，但将有前景的临床前引导转化为临床有效的疗法的成功率仍然非常低，其中绝大多数都在转化的“死亡谷”中消失。我们考虑了可能导致这个问题的一些因素（总结在表2中）。

当前的方法经过优化，以实现高重复性和低组内变异，从而去除了许多非技术性但与疾病相关的变异来源。重新引入其中的一些变异可能会使临床前模型更具有预测临床效果的能力，同时，如果在个体而不是队列层面进行结果分析，它还可以为生物标志物的发现提供变异基质。

局部微环境很重要

皮下部位是肿瘤细胞植入最常用的部位，因为手术和随后的监测都很简单。然而，随之发展的肿瘤基质可能与原位部位非常不同，这会影响肿瘤生物学和对治疗的反应。肿瘤的血管化和免疫浸润随植入部位而变化，肿瘤内的信号通路也会根据微环境重新布线。在一个戏剧性的例子中，结肠癌模型在皮下部位对免疫检查点抑制反应，但在原位（结肠）或自然转移（肝脏）部位则不反应。因此，尽管成本和难度都增加了，但应尽可能使用原位植入。重要的是，使用非常快速生长的侵袭性肿瘤通常意味着在仍然存在对移植细胞的急性炎症反应期间开始治疗，这会扭曲微环境。使用生长较慢的模型允许在治疗开始前解决急性反应，并可能产生更有意义的结果。

重复性与鲁棒性：纳入并接受自然变异

最近，临床前建模研究中的重复性和严格性缺乏受到了很多关注，导致新药在早期临床试验中的失败率很高。 严格性，即在所有情况下最小化技术缺陷和变量，显然是至关重要的。在严格控制的条件下，生物观察或药物反应的重复性显然是药物/靶点开发的关键第一步。然而，当纳入自然的非技术性变异来源时，发现的鲁棒性可能比单纯的重复性更重要，以提高临床可转化性。临床前模型的治疗干预研究——按设计——通常会消除尽可能多的变量。在极端情况下，这种方法涉及将基因相同（克隆）的肿瘤细胞植入基因相同的小鼠中，并在环境受控的条件下饲养。这些研究中自动构建了一些不可减少的变异性，因为即使是基因相同的小鼠也在表观遗传上是不同的。然而，许多其他相关的变异来源已经被排除在外。例如，当使用免疫完整的动物时，它们通常在异常卫生的（特定病原体自由）条件下饲养，并且具有与新生儿人类相似的不成熟免疫系统。微生物组的低多样性的影响可能超出了免疫系统，因为微生物组塑造了许多生理和病理反应，包括对化疗的反应。此外，大多数实验都是用非常年轻的小鼠进行的，通常相当于人类的青少年，而非儿科的人类肿瘤通常是老年疾病。随着机体的老化，许多与肿瘤进展相关的生物特征发生了相应的变化，如肿瘤微环境中的促肿瘤衰老细胞的增加、免疫反

应的改变和“炎症老化”，无疑会影响对治疗的反应。最后，大多数临床前小鼠研究使用的只是几种近交小鼠品系（例如，C57Bl/6、BALB/c、FVB/N）限制了对遗传背景和修饰基因对肿瘤发展和治疗反应的影响的分析。可以利用如“合作交叉”的遗传多样性小鼠资源来引入人群中发现的遗传背景多样性。与不同小鼠品系的交叉的MMTV-PyVT GEM乳腺癌模型揭示了许多影响转移效率的遗传等位变异。

现有的最小化自然变异的策略优化了实验的信噪比，对于在理想条件下快速筛选新的治疗方法的效果是有意义的。然而，结果可能仅限于模型的严格受限的具体情况，重要的是，这种方法减少了利用自然变异性产生的信息的机会，这些信息对于临床试验设计是有价值的。预先筛选出的有希望的临床前研究后，随后的研究可能会尝试将更真实的异质性引入到系统中。这将导致治疗反应的更大变异性。然而，如果小鼠是作为个体而不是在队列层面进行分析，那么从治疗反应的分布曲线的两端都可以获得信息。超级反应者和非反应者的属性可以被挖掘，以获得对抗性机制的深入了解，生成预测生物标志物以选择患者，并确定强反应的决定因素，这些决定因素可以在联合治疗方法中被利用。使用更大的队列进行的研究，这些队列捕获了更多的相关生物异质性，无疑会更昂贵，但与临床试验阶段的失败成本相比，成本仍然很低。

转移作为临床相关的终点

大多数死于癌症的患者通常是死于对治疗抵抗的转移性疾病。如前所述，肿瘤细胞的局部微环境在对治疗的反应中可能起决定性作用。然而，出于实际原因，几乎所有的临床前治疗干预研究历史上都使用原发性肿瘤大小而不是转移负荷作为终点。临床前策略评估治疗干预能否缩小已建立的转移病灶或防止其发展/进一步进展，这更符合临床目标。60 这里的挑战包括建立现实模型和临床前监测转移负荷的困难（框1）。由于大多数GEM模型和大多数PDXs的转移效率低，因此迫切需要具有更高转移效率的现实模型。一个最近的进展是开发了从CTCs派生的模型。由于这种方法的潜在重要性，我们在这里详细探讨它。

从CTCs派生的模型

虽然人类临床材料从原发性肿瘤中容易获得以建立PDXs，但转移病灶很少被活检或手术切除。快速尸检程序可能会产生活的转移组织，但这些并不普遍，因此建立进化转移疾病的PDX模型是一个挑战。与此同时，使用CTCs作为这个目标的中间步骤正在取得有趣的进展。

CTCs是一种从原发性肿瘤或转移部位进入血流并作为转移前体的细胞群体，在转移和疾病进展中起着中心作用。CTCs存在于血液中；因此，液体活检（抽血）就足以捕获和分离CTCs。液体活检对患者的风险最小，可以对所有癌症进行，且允许在治疗期间进行纵向研究。相比之下，组织活检风险高，对于一些癌症，特别是在治疗期间需要重复取样时，不可行。使用液体活检对CTCs进行纵向监测，可以评估肿瘤的进化和评估治疗结果。这种监测可能有助于实现个性化治疗策略，因为患者的肿瘤对正在进行的治疗产生抵抗。此外，单细胞突变分析的早期结果显示，CTCs携带的新突变在原发性肿瘤中未发现，这表明转移细胞的生物学和可药物靶向的目标与潜在的原发性肿瘤不同。因此，CTCs对于开发新的转移特异性治疗策略具有前景。

二十年前，人们就证明了仅通过计数CTCs就可以提供无病生存（PFS）和总生存（OS）的独立预测因子。通常使用大于1-5 CTCs/7.5毫升血液的截止值来分层患者。这些数字也说明了CTCs的稀有性，它们通常在血液中以每109个血液细胞中有一个CTC的频率出现。在FDA批准并商业化CellSearch技术后，对各种类型的癌症进行了研究，并证实了大于1-5 CTCs/7.5毫升血液的计数与较差的PFS和OS相关。从纵向血液抽取中计数CTCs已被证明是监测肿瘤对治疗反应的好工具。虽然CTC计数已经显示出临床效用，但它并未提供可用于额外分析的活CTCs。在体外分离和扩增CTCs以产生足够数量的这些稀有细胞是非常可取的，用于最先进的基因组和蛋白质组分析，活细胞药物筛选，全细胞和mRNA肿瘤疫苗开发，研究CTCs在转移中的作用，以及新的患者源转移模型涉及免疫组分。重要的是，已经证明CTC培养或CTC源异种移植物（CDXs）显示出与患者相似的对化疗药物的反应，并且已经假设CTC培养/CDX模型可以用于指导临床决策。

CTCs培养

从患者样本中常规扩增CTCs的主要挑战是它们的稀有性（低至1个细胞/8.5毫升血液）和脆弱性（对粗糙隔离程序的敏感性）。用于隔离CTCs以在培养中扩增的方法基于：（1）使用抗体（如抗EpCAM）针对CTC特异性细胞表面标记物，或（2）使用基于细胞物理属性的微流控设备选择CTCs，无论是否使用针对细胞表面标记物的抗体。一般来说，收获的是上皮细胞，它们是EpCAM+，而白细胞则是CD45+，被移除。虽然这些方法可能有用，但在培养和扩增CTCs方面的成功非常有限。

举例来说，在首次报告成功培养CTCs的文章中，从被诊断为脑转移性乳腺癌的患者中建立了三个CTC系。这篇报告使用了针对CD45−/ALDH1+细胞的多参数荧光激活细胞分选（FACS）从全血中分选。在培养中扩增的CTCs被注射到免疫缺陷的小鼠中，其中EpCAM−的脑转移性CTCs的亚群在注射后约6周内在80%的小鼠中导致肺和脑的转移。这个在体外培养/扩增CTCs方面的开创性进步被CTCs培养只能在38个患者中的3个人建立的事实所抑制。通过证明CTCs可以是EpCAM−，并且这样的CTCs在培养中存活的时间更长，这项研究也反对将EpCAM作为选择CTCs的首选细胞表面标记。事实上，后续使用抗体依赖性隔离方法的研究也显示出较差的成功率。

另一种方法，使用器官样培养，导致从一个CTC计数高的患者（>100个细胞/8毫升血液）生成了一个CTC细胞系，并显示出CTCs中新突变的出现可能与它们增加的转移能力有关。

新出现的CTCs异质性的报告也反对使用有限数量的细胞表面标记来定义/隔离CTCs。例如，在来自转移性乳腺癌的CTCs中，一些CTCs主要表达上皮标记，而其他CTCs表达间充质标记。此外，表达间充质标记的CTCs在体内显示出增加的转移能力。因此，我们和其他人引入了新的方法来捕获CTCs，而不受抗体和/或大小选择引入的偏见的影响。

在体内，CTCs存在为单个细胞或异质性簇，其中包括额外的细胞群体，如白细胞或癌症相关成纤维细胞。新出现的数据表明，非肿瘤细胞对CTCs的活力和在培养中的扩增是重要的；因此，强调只有无偏见的非抗体依赖性协议才能允许收集CTCs和非CTCs细胞进行培养是很重要的。我们最近报道了成功的短期培养来自12个被诊断为III/IV期转移性乳腺癌患者的CTCs，只使用Ficoll梯度隔离CTCs，但依赖于培养条件选择性扩增CTCs。所有包含在研究中的患者都成功建立了培养，培养的活力与共培养的粘附CD45+细胞有关。使用计算解卷积工具包对RNA测序（RNA-seq）数据进行分析，这些混合培养被显示为由少量的中性粒细胞和单核细胞组成。随后，使用相同的方法成功地从非小细胞肺癌（NSCLC）、胰腺和结肠癌建立了CTC培养，总的成功率为93%。这是首次证明同一种方法可以成功地用于从各种肿瘤类型建立CTC培养。随着研究人员对CTCs自然环境的理解不断扩大，更有效的体外培养/培养条件可能会提高建立CTC培养的成功率。

CDX模型

建立CDX模型的大多数研究使用新鲜隔离的CTCs，而少数在注射到NSG小鼠之前扩增CTCs。从新鲜CTCs生成的CDX模型的长潜伏期（6-12个月），即使成功，也是限制其临床应用的关键因素。当使用新鲜隔离的CTCs时，大多数癌症类型的总成功率非常有限（≤10%），因为需要≥400个CTCs。小细胞肺癌是一个例外，因为这些患者经常有≥1000个CTCs/7.5毫升血液，导致成功率高达约50%。

在首次证明可以可靠地传递CTCs作为CDXs的研究中，研究人员从六个化疗敏感或化疗耐药的小细胞肺癌（SCLC）患者中获取了纵向血液样本。在植入后的4个月内，使用4个患者的细胞在注射部位检测到可触及的肿瘤。CDXs显示出典型的SCLC形态和神经内分泌标记，与患者肿瘤一致。虽然没有观察到大转移病灶，但在一个CDX模型中检测到了微转移病灶。CDX（传代4）对顺铂和依托泊苷的敏感性与患者的反应密切相似。最后，对CDX组织的基因组分析显示，CDXs保持了SCLC的定义特征以及它们各自的患者原发性肿瘤。同样，在一个病例研究中，从一个未经治疗的NSCLC患者中开发了一个CDX模型，并在患者死后进行了表征。患者在出现进展性神经症状后停止了顺铂和培美曲塞的治疗。这些药物在CDX中并未影响肿瘤生长，这表明治疗可能并未改善患者的预后。除了预测患者反应，CDXs也有助于识别转移的分子驱动因素，因为CDX模型提供了可再生的、源自患者的CTC材料的来源。

最近的一项研究探索了一种不同的方法，通过从一个CRPC患者创建一个永久的CDX源单层贴壁细胞系。这个细胞系被证明表达癌症特异性标记，并能在小鼠中建立肿瘤。使用CDX体内模型或CDX源细胞系进行的药物试验显示，与患者相同的对多西他赛和恩唑鲁胺的敏感性。这种方法的优点是体外传代代表了扩增CTCs的更可扩展的替代方案。

像CTC培养一样，成功建立CDX模型与注射的CTCs数量密切相关。只有当患者血液中含有>400个CTCs/7.5毫升血液时，才能建立CDX模型。因此，对于CTCs数量较少的患者（更常见的情况），在注射之前扩增CTCs是必要的步骤。这种方法的一个例子是从一个晚期胰腺癌患者扩增CTCs，产生约106个CTCs用于注射。在3-4周内检测到可触及的肿瘤，并在所有小鼠的肝脏和胰腺观察到与胰腺癌一致的大转移病灶，这是一种腺泡反应的特征。我们最近也证明了初始扩增CTCs提供了从患者样本常规建立CDX原发性肿瘤的可靠选项。在我们的研究中，我们从结肠和胰腺癌CTCs建立了CDX模型，所有的模型都显示出大转移病灶，部分与患者的转移模式重叠。

CTC模型的未来

在过去的十年中，体外和体内CTC模型的重要性已经得到证明。新出现的数据似乎支持这样的观点，即无偏见的捕获CTCs然后使用培养条件选择性扩增CTCs比依赖于使用细胞表面标记物隔离CTCs的技术更成功。使用来自多种癌症的样本的众多研究也表明，注射到小鼠中的CTCs数量是成功建立CDXs的最重要因素。只有对一些癌症才能获得大量的CTCs，因此，从个体患者中常规建立CDX模型将依赖于在体外扩增CTCs。建立经过验证的培养基/试剂、协议和平台技术，允许从患者中常规建立CTC和CDX模型是一个关键的未满足的需求。目前，只有不到50个CTC源细胞系和不到50个在体外存活至少一年的CDX模型。这些数字不足以理解转移过程并开发针对转移性疾病的药物。此外，可以广泛利用的平台技术，用于从个体患者开发体外和体内模型，可能是开发个性化治疗策略的重要工具。这是因为研究已经证明CDX模型和患者有相似的药物敏感性/抗性。因为转移性结节经常在表型/基因上与原发性肿瘤不同，所以对转移性疾病的个性化治疗也是可取的。不幸的是，转移性疾病的患者病情严重，预期寿命短。因此，允许快速建立CTC培养和CDX模型的短潜伏期的技术改进对于这些模型的有效临床使用至关重要。

由于目前对参与转移级联的重要参与者和宿主微环境的理解有限，几乎不可能在体外复制微环境。然而，CDX模型为CTCs提供了一个自然的体内环境。此外，CDX模型允许自然选择预先转移的CTCs亚群。

CDX模型的一个重要限制是使用小鼠微环境扩增人CTCs。在未来，这个缺点可能至少部分地通过使用人源化的小鼠得到补救。

另一个关键的技术挑战是远程采血和运输活的CTCs。当前的协议依赖于本地采集血液样本并立即建立培养和/或体内模型。如果要将CTC模型整合到复杂的多中心临床试验或常规医疗实践中，就必须开发和验证在从个体站点采集和运输后在中央实验室建立CTC模型的方法。如果能克服这些技术挑战，CTC模型可以用于图2中概述的各种应用。

果蝇、斑马鱼、鱼和人的对比？

果蝇用于建立癌症模型和高通量药物筛选

如急性髓性白血病（AML）和肺、甲状腺、前列腺、结肠和脑癌等癌症已在果蝇中建模。在一个例子中，使用来自癌症基因组图谱（TCGA）的遗传数据的结肠癌果蝇模型重建了与相应突变观察到的人类病理现象相匹配的表型。然后使用这些多基因线进行高通量药物发现筛选。果蝇可以很容易地进行遗传操作，并且适合于高分辨率活体成像以及化学筛选。然而，果蝇中缺乏适应性免疫系统。因此，无法在此模型中测试免疫疗法。

斑马鱼用于更完整的微环境建模

相比之下，斑马鱼拥有一个与人和小鼠高度保守的完整免疫系统。血管和淋巴管以及如胸腺和心脏等器官在斑马鱼中是保守的，并在早期发育中形成。已经使用幼鱼和成年斑马鱼生成了GEM和异种移植模型。如T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）、横纹肌肉瘤、黑色素瘤、周围神经鞘瘤、胰腺神经内分泌肿瘤和神经母细胞瘤等癌症已在斑马鱼中生成。黑色素瘤和T-ALL斑马鱼模型显示出与人类患者常见的转移部位。这些模型采用的是人类或斑马鱼的人类疾病的同源基因的遗传驱动因素。然而，有可能生成更多的不同癌症的基因工程鱼模型，因为人类中80%的疾病相关基因在斑马鱼中是保守的。在异种移植模型中，如黑色素瘤、胶质母细胞瘤和乳腺、结肠和血液癌症等人类癌症已经被引入到幼鱼的早期阶段，通过直接进入循环或通过卵黄囊来模拟扩散。这些试验通常持续3-7天，因为人类肿瘤细胞在9天大的鱼中被新出现的适应性免疫系统清除。然而，最近生成了一个免疫缺陷的斑马鱼模型，这些鱼可以在37°C下生存，解决了在较低温度下维持的幼虫试验中缺失的另一个因素。在这种“重度联合免疫缺陷（SCID）”鱼中，许多癌症的PDX移植物至少存活了一个月。最近，一个概念验证研究证明了“人源化”斑马鱼的想法。简单地说，引入的造血干细胞和人单核细胞/巨噬细胞保留了组织特异性功能。这些和未来的研究将进一步揭示基质环境在疾病进展和药物反应中的作用。

斑马鱼的成像和生物物理测量

斑马鱼模型的一个优点是广泛的转基因模型，这些模型荧光标记了许多类型的细胞，包括用于谱系追踪的条形码。在与哺乳动物系统相当的血流下，人类细胞在血管内的运动以亚细胞分辨率在先天免疫细胞存在下被可视化。此外，使用原子力显微镜、光陷阱主动微流变学和布里渊显微镜等技术对幼鱼进行生物物理测量，揭示了与哺乳动物细胞外基质的生物物理属性的相似性。斑马鱼的光学和机械映射的便利性为细胞外渗和器官特异性定居的机械生物学角色提供了见解。在斑马鱼中，血流影响了癌细胞的毛细血管阻塞和随后的细胞外渗，其中更大的血流导致更多的细胞到达感兴趣的器官，但只有当流体力小于内皮细胞内的粘附力时，才能实现毛细血管阻塞和随后的细胞外渗。毛细血管的物理结构——拓扑无序与线性分支毛细血管——也影响了器官特异性乳腺癌细胞系在体内的器官特异性结合。蛋白质组学剖析器官特异性表达揭示，活化的beta 1整合素和肌球蛋白1B的差异表达揭示了更多的拓扑无序和线性分支毛细血管的优先定植。此外，YAP，一种机械敏感蛋白，调控了毛细血管内的迁移。具体来说，肿瘤细胞并没有在首次遇到的毛细血管床中卡住，而是可以迁移到其他毛细血管床，然后最终发生细胞外渗。

斑马鱼模型的另一个优点是其大小适合于人类使用的模式。功能模式如功能磁共振成像（fMRI）、磁共振弹性成像（MRE）、荧光和正电子发射断层扫描（PET）已被用来评估新陈代谢、血流和组织机械性能等指标。因此，斑马鱼是一个允许跨物种比较多重模式的潜在模型。

斑马鱼用于高通量筛选和药代动力学

这个系统是一个有前景的体内筛选平台，用于精准医疗，因为每对交配对可以产生数百个幼虫。临床相关的药物如二甲双胍、达沙替尼、西妥昔单抗、贝伐单抗和PARP抑制剂已经被评估用于高通量筛选中的肿瘤清除。一个研究揭示了斑马鱼注射结肠癌细胞系后对结肠癌疗法的差异敏感性。此外，注射了从患者身上分离出的细胞的斑马鱼显示出与患者反应匹配的药物反应。这是一个令人兴奋的结果，因为当这些细胞在二维（2D）试验中培养时，并未观察到差异敏感性。不仅限于幼虫“zevatars”，成年鱼的异种移植模型也可以用于药物试验。药物可以通过口服灌

流和腹腔注射方便地给药。在一项研究中，成年免疫缺陷斑马鱼的横纹肌肉瘤异种移植物确定了联合使用Olaparib-PARP抑制剂和temozolomide-DNA损伤剂的临床效果作为有效疗法。这种组合方法在凋亡开始前驱动细胞周期停滞。此外，temozolomide和Olaparib在成年斑马鱼中的药代动力学结果与在小鼠和人类中测得的值相当。因此，评估斑马鱼的药代动力学可能是预测人类中相似值的第一步。这些系统提供了降低成本的优点，并已进入临床试验，但要注意的是，适应性免疫系统是缺失的。

鱼用于适当年龄的微环境

这些模型也允许解剖癌症从突变到转移的演变。然而，评估疾病在与人类发病相当的年龄时仍然困难且昂贵，需要在几个模型中重建。一个新兴的衰老模型是鱼，这是一种原产于非洲的物种，其平均寿命范围从9到28周。最近的研究集中在复制神经退行性疾病和年龄诱导的蛋白质聚集和质量控制丧失。然而，早期研究表明，在老鱼的尸体分析后，肝脏、肾脏、心脏和性腺中存在肿瘤。在突变的p53肝脏肿瘤中观察到肿瘤发生率最高，其中更多的雄性有肝脏肿瘤——这也是人类观察到的特征。这些研究提供了令人着迷的证据，表明可以在鱼中研究年龄依赖性的自发肿瘤。此外，鱼与人类和其他动物模型分享许多同源基因。它们也与斑马鱼在繁殖力和大小上有相似之处；因此，光学操作和高通量药物筛选是可能的。器官系统以及神经和免疫系统也与人类中发现的保守。重要的是，已经建立了一个CRISPR-Cas9基因编辑流水线，该流水线允许以非常高的效率进行敲除和敲入。因此，有可能使用这个模型来研究与年龄相关的癌症。

使用三维培养填补空白

三维（3D）试验在区分癌症和正常行为方面起到了关键作用。例如，当肿瘤细胞在软琼脂中培养时，显示出锚定独立生长，而正常细胞无法增殖并随后死亡。这种体外试验通常能预测当这些细胞被植入小鼠时的体内生长和化疗敏感性。在这些初步研究的基础上，3D培养已经发展到包含体内微环境的复杂性。技术的创新，如微制造，对基础生物学的更深入理解，以及标准试剂的增加，如富含层粘连蛋白的ECM和用于体外再现体内表型的聚二甲基硅氧烷（PDMS），使我们的开发和评估疗法的方法民主化和标准化。不同的设计原则已经被采用来重建肿瘤中发现的同型和异型细胞-细胞，细胞-ECM，和细胞-组织相互作用。系统采用永生化癌细胞系，诱导的多能干细胞（iPSCs），和新鲜切除的完整和解离的患者和动物组织来评估异型和/或同型细胞-细胞相互作用和混合正常-肿瘤细胞复合物。这些系统也可以与微流控试验集成，以包含流动，模拟废物、营养物和生理剪切力的交换。此外，它们允许全人化相互作用的优点，具有定制的化学计量比。这允许确认在小鼠研究中观察到的药物效力与人类疾病的相似性。此外，它们适用于广泛的平台，如显微镜和光谱成像以及机械和代谢方法。此外，使用3D培养模型进行高通量成像和药物筛选是可能的，这在小鼠中进行是具有挑战性的。由于易于合成标记和组织大小的减小，可以观察到亚细胞和细胞信号。根据3D培养模型的选择，由于微组织在培养中的存活时间增加，也可以进行几周的纵向监测。因此，可以比在小鼠模型中目前可能的更详细地检查癌症进展的困难阶段，如入血管、出血管和癌细胞在血管中的运输。这些系统可以反过来用于筛选不同疾病阶段的患者的药物效果。它们可以被分类为以下设计，并在图4中显示：（1）无支架，（2）器官型外植物，和（3）工程模型。

模拟器官特异性微环境

每个部位的器官微环境都是不同的。例如，原发性黑色素瘤的正常对应物是黑色素细胞。然而，对于黑色素瘤脑转移，肿瘤会遇到脑内驻留的星形胶质细胞和少突胶质细胞。组织驻留免疫细胞和血管也显示出器官特异性的功能和蛋白质表达。器官显示出不同的生物物理指标，如组织粘弹性和结构。这些物理化学线索是疾病进展和药物反应的强大决定因素。3D模型允许通过调整浓度、交联和配体可用性来控制ECM的物理属性。此外，可以在定义的比例和空间结构中组装正常环境中驻留的不同细胞类型，以重建组织复杂性。

ECM的生物物理和生物学

开创性的工作证明了微环境在再现正常上皮和肿瘤中的重要性。Bissell和同事们证明，人乳腺上皮细胞在3D lrECM中形成极化的微组织，而恶性对应物在3D lrECM中形成肿瘤。值得注意的是，当这些细胞在2D基质上培养时，没有形成3D结构。此外，在3D和2D培养的细胞之间观察到了对增殖、迁移、凋亡和药物敏感性重要的差异信号。这些“3D”培养模型可以分为（1）孤立的单个细胞，（2）肿瘤的完整片段，和（3）预聚集的聚集体。可以使用细胞源性基质、地下膜替代物如lrECM或基质ECM替代物如Ⅰ型胶原和透明质酸（HA）来再现微环境。培养方法可以由完全包裹在水凝胶中的细胞或组织组成，或者由细胞坐在厚厚的水凝胶上，培养基以给定的体积/体积（v/v）补充。像海藻酸、聚（乙二醇）（pEG）和琼脂糖这样的材料也允许包裹，其中蛋白质浓度、交联和结合可以被调节。此外，也可以实现调节基质的物理属性，如粘弹性。通过使用功能化的磁性颗粒、3D打印或微流控，也可以将控制的各向异性，如纤维状结构，引入到ECM水凝胶中。细胞也可以在去细胞化的器官中播种，其中保留了原生结构。这些培养模型通常在几天的时间内，允许检查对药物疗法的急性反应。在这些静态模型中，由于营养物和氧气的质量传输限制，以及废物的交换，直径大于1毫米的组织中存在低氧区域，延长存活时间减少。生物反应器和最近的器官样培养方法采用了克服这些限制的方法，其中存活时间可以从几个月到一年。

组织生物反应器用于体外再现微环境

在组织工程领域，生物反应器已经生成了诸如皮肤、骨、软骨和神经等组织。例如，像皮肤移植物这样的组织已经商业化，用于烧伤患者。这种方法的一个版本涉及将细胞播种在由合成或天然聚合物衍生的支架上。支架的物理化学性质可以被定制以模拟体内的器官。通过旋转样品或外部灌流系统进行机械搅拌，实现了质量传输的改善，以去除外部废物和提供营养物，实现均匀播种。此外，这些系统证明，通过应用物理力，如剪切应力、循环张力、压缩和差压，这些模拟体内条件，提高了组织功能。这些外部线索有助于形成血管和骨、心脏和软骨组织，这些组织再现了形态和组织特异性功能。肿

瘤是生态系统，其中基质细胞驱动进展、生存和药物反应。同样，癌细胞已经在生物反应器中播种，以评估原发性肿瘤和转移性生长。通过将癌细胞与如成纤维细胞、组织驻留巨噬细胞、内皮细胞和浸润性淋巴细胞（如T细胞）等细胞共培养，实现了体外肿瘤环境的更完整再现。

3D器官样培养以更好地模拟体外组织和肿瘤组织

器官样技术为实现形态和功能提供了对历史3D培养模型的现代更新。在开创性的工作中，可以从嵌入lrECM水凝胶的小鼠肠道干细胞的克隆扩张和分化中获得具有分化绒毛的肠道隐窝。器官特异性位点的元素可以被纳入以延长寿命和功能。具体来说，将与肌纤维细胞共培养的新生小鼠肠道原始组织嵌入胶原水凝胶，并采用空气-液体界面几何形状，结果得到的组织能分泌粘液，并存活了大约1年。体内发现的一些空间各向异性在体外并不容易获得。因此，3D生物打印已被用来创建组织特异性的几何形状。通过微模塑胶原凝胶，创建了肠道隐窝的平面结构。然后将分离的细胞播种到这些预制的凝胶中，形成了一个可供成像的腔室空间。生物打印也被用来从器官样构建宏观尺度的组织。最近，使用修改的器官样协议生成了厘米级的组织。3D打印可以用来生成空间各向异性，如在分支形态发生、分层和极化上皮以及混合组织界面中观察到的那样。预计，这项技术在组织工程和癌症发现中的使用将有所增加。现在，常规构建的上皮包括胰腺、乳腺、胃、肝和结肠。长期培养的肿瘤也可以从乳腺、结肠、肝、子宫内膜和胰腺肿瘤等原发性和转移性肿瘤的活检中生成。此外，也可以收集相邻的正常组织以比较药物反应。存在许多癌症的患者源癌症和正常匹配组织器官样的私人和商业生物库。高通量成像、基因编辑、空间转录组和蛋白质组分析以及药物筛选常常应用于器官样。我们随后强调了在构建肿瘤生态系统中纳入多种细胞类型的方法。

三明治方法涉及将肿瘤细胞播种在基质细胞的饲养层上。肿瘤细胞也可以嵌入到定制的ECM物理化学属性的水凝胶中。然而，“芯片基础”的系统提供了更大的对细胞位置和物理化学环境线索的时空控制。这种方法最初被Schuler和同事们设想为“芯片上的动物”。微设备和微流控在从mm2到cm2的芯片中空间定义一个或多个细胞类型。进出口便于流体和趋化因子和氧气的梯度的交付和交换。可以在流体输送过程中编程生理力，如类似于体内淋巴和血液运输的层流或脉动流。可以将呼吸和心跳期间观察到的循环应变应用到模拟平台。可以通过微印刷生成具有可塑粘附性质的不同机械性质的基质。如肺、肝、肾、肠、心、皮肤和大脑等器官现在已经商业化。可以在“芯片上”模拟癌症、哮喘和炎症性肠病等疾病。这项技术已经模拟了在原发性和转移性生态位以及侵袭性和惰性癌症中的肿瘤生长。在尾部微环境的基质细胞和ECM芯片上，乳腺、肺、脑和卵巢癌症已经研究了基质细胞在肿瘤生长和药物敏感性中的作用。“多器官芯片”，其中一套器官与模拟血管的微流控和组织相互连接，可以用来理解肿瘤逃逸、转移和殖民新组织的机制。此外，可以检查全身药物反应，如药代动力学和药物清除，因为可以纳入肾、心、肝和肠等器官。通过纳入患者源的原发性组织，这些“芯片”是个性化医疗的强大工具。它们使得可以在疾病进展的不同阶段使用患者组织，并测试可能预测哪种治疗将起作用的不同浓度和药物组合。

入血管和出血管

在小鼠中，转移的两个阶段仍然技术上难以直接观察：（1）单个或肿瘤细胞团从原发性肿瘤逃逸，和（2）从循环中退出并进入次级部位。肿瘤细胞可以与成纤维细胞和驻留巨噬细胞形成复合物，以帮助从细胞外环境中脱离。此外，肿瘤细胞团可以招募血小板以在血管中生存剪切应力。无ECM支架的多细胞聚集体试验是良好的替代品。这些过程可以在体外模拟。这些试验要么是短期的（大约24-48小时），要么持续几周。重要的是，可以调节外部生物物理参数，并可以评估通过粘附力对细胞合作性的影响。

可以利用器官芯片技术工程化完整的带有血管的正位器官环境，以再现入血管和出血管的重要条件。将工程化的血管与器官样相融合，形成内皮细胞的互连通道，模拟血管或淋巴管。在入血管过程中，原发性肿瘤器官样与工程化血管耦合。相反，将肿瘤细胞引入到内皮网络中，这些网络与“次级部位”耦合，以模拟出血管。可以使用蠕动泵将可变的剪切力引入到系统中。也可以引入不同类型的免疫细胞。这些模块化平台可以设计成纳入多个器官环境，以评估驱动逃逸和进入转移部位以及器官特异性的机制。最近，使用骨和肌肉生物模拟物研究了转移性乳腺癌细胞的器官特异性殖民。乳腺癌细胞引入到血管部位，显示出对“骨模拟物”的优先殖民。已经证明，腺苷可以将殖民重定向到“肌肉模拟物”。像乳腺导管原位癌（DCIS）这样的肿瘤也已经使用这些系统进行了模拟。在原位癌阶段，流氓细胞的逃逸可能发生，因此在这个阶段模拟逃逸对于确定改进的个性化治疗特别有信息。

在3D中评估治疗方法

细胞信号、增殖和运动性受培养条件的调控。此外，趋化因子的扩散和结合动力学也受组织各向异性的调控。因此，我们在预测个性化药物效力和临床试验中的非靶向药物毒性方面的成功有限。因此，已经转向使用3D培养模型作为使用高通量筛选单一和组合化合物的早期临床毒理学研究的第一步。最近，器官样生物库已被用于新药发现。到目前为止，器官样生物库包含了乳腺、前列腺、肺、胰腺和结肠癌患者的样本，数量从几十到几百。从原发性和转移性、新辅助和辅助设置中的肿瘤和相邻正常组织中派生的器官样，允许在不同的扰动后评估药物效力。这些生物库也可以用来解决健康不平等，因为临床试验并未充分招募来自边缘化群体和罕见癌症的患者。可能的是，器官样可以用来预测当前治疗或那些在管道中的患者的反应者和非反应者。最近，化疗药物对作为器官样生长的患者源组织的活检的效力与结直肠癌患者的反应相关。此外，使用荧光寿命显微镜（FLIM）对器官样的细胞代谢进行无创成像，测量了患者源的原发性乳腺癌器官样的抗肿瘤药物反应。这种方法也预测了小鼠异种移植物的治疗反应。其中一个令人兴奋的突破将是能够预测转移性疾病的患者反应。正在进行的工作正在评估这种可能性，其中包括使用转移性疾病的活检样本。

结论

在单细胞和空间基因组学、高维度成像和流式细胞术以及人工智能的技术进步下，我们可以直接从临床研究中获取越来越丰富的信息。临床前模型系统应该通过药物和生物标志物的发现来补充（并通过机制分析来增强）我们从临床研究中学到的知识。相反，临床观察应该指导改进模型设计。临床医生和基础科学家之间更紧密的合作将使这个迭代过程更有效。允许进行多重方法的临床前模型，如纵向高分辨率显微镜和代谢和机械分析，正在逐渐显现出特别强大的能力，因为人们越来越认识到，诸如缺氧、代谢、免疫浸润以及ECM微环境的生化和物理属性等因素都可以影响药物的效力。在我们对当前模型的概述中，我们强调了不同模型在不同目的下的优点和缺点。我们认为，如果在小鼠模型中接纳更多的人类疾病的复杂性，可能会使药物靶点发现和效力测试的临床前阶段更具预测性。对于未来的小鼠模型，重要的目标将是改进人类免疫系统的建模以发展免疫疗法，扩大人类异种移植面板以包括更多的种族多样性，并扩大相当有限的转移模型的选择。同时，体外培养模型的复杂性和精细度正在提高到新的立法不再要求FDA强制对新药进行动物测试的程度（https://www.science.org/content/article/fda-no-longer-needs-require-animal-tests-human-drug-trials），看到这项立法如何改变未来临床前药物开发的格局将会很有趣。

计算模型是一个被低估的工具，可以模拟多因素肿瘤动态和异质性在多个长度和时间尺度上，这些在实验模型中很难重现。最近，结合建模和临床前和临床研究的免疫学和免疫疗法，已经在解析肿瘤环境中免疫细胞激活的复杂性方面发挥了重要作用。因此，计算模型补充了实验研究，并可以利用现有的数据集。这些模型可以被划分为确定性微分方程模型和随机基于代理的建模等类别。它们可以用来描述动态或预测行为，模拟单个实体（如细胞）的离散行为，并施加一组定义的规则。每种方法都有其优点，可以用来回答与肿瘤-免疫相互作用相关的特定生物问题，包括细胞内信号、细胞-细胞相互作用和全身动态。然而，这些方法是有前景的，因为这些模型可以提供一个框架，可以用来了解哪些途径可能被利用来提高免疫疗法的效果。

最后，未来的一个雄心勃勃的目标可能是提高和加快建立患者源模型（如肿瘤器官样）的效率和速度，以便在一个时间框架和成本内进行并行的临床试验和临床前研究，以指导治疗选择，这样个性化精准医疗就可以更广泛地实践。

文章来源：https://doi.org/10.1016/j.cell.2023.02.026