Bulk和scRNA-seq的综合分析揭示与心力衰竭相关的细胞类型
Bulk和scRNA-seq的综合分析揭示与心力衰竭相关的细胞类型
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题目：Integrative Analysis of Bulk and Single-Cell RNA Sequencing Data Reveals Cell Types Involved in Heart Failure 期刊：Front Bioeng Biotechnol.（Q1 IF：5.7） 日期：05/January/2022 DOI：https://doi.org/10.3389/fbioe.2021.779225
心力衰竭(HF)是一种慢性进行性综合症，死亡率很高。HF是一种严重的心功能障碍，其特征是射血功能或心室充盈功能受损，或两者兼而有之。心衰给卫生保健系统带来了相当大的负担，而且发病率的上升与多种因素有关：年龄、肥胖、高血压、糖尿病、缺血性心脏病、合并症、遗传、环境等，使其难以预测。
心衰的发病机制涉及复杂的生物学过程，况且心衰与高且不可预测的死亡率相关，因此探索潜在的心衰生物标志物很有意义。单细胞RNA测序(scRNA-seq)技术的进步为我们在分子水平上表征HF相关细胞类型提供了另一种方法，使其在HF研究中得到广泛应用。然而，由于scRNA-seq数据样本量相对较小，并且对HF中某些细胞类型和细胞类型特异性基因变异的机制研究需要将scRNA-seq和大量RNAseq数据进行整合分析。
该研究通过整合整体和单细胞RNA测序数据，鉴定HF中一些新的细胞类型、细胞类型特异性基因和关键成分，并期望揭示参与DCM和ICM的细胞类型，从而更清晰地展示HF的免疫炎症反应。
摘要
心衰（HF）死亡率高，机制不明，因此对遗传因素的彻底鉴定将为这种心功能障碍的分子基础提供新的见解。
该研究对公开数据库进行挖掘，包括非衰竭(NF)、扩张型心肌病(DCM)和缺血性心肌病(ICM)心脏组织。通过主成分分析(PCA)、基因差异表达分析、基因集富集分析(GSEA)和基因集变异分析(GSVA)，找到了HF、内皮细胞(EC)和心脏纤维化特异性生物标志物中显著改变的候选基因，验证了炎症相关细胞粘附分子(CAMs)、细胞外基质(ECM)基因和免疫反应的差异。
其结果表明，EC和成纤维细胞可以在HF的作用下被激活。DCM与ICM在HF发病机制上既有共性又有特异性。ICM中较高的炎症可能与自分泌CCL3/CCL4-CCR5相互作用诱导的趋化因子信号激活有关。此外，ICM的中性粒细胞和巨噬细胞活性高于DCM。这些发现确定了以前被低估的ICM和DCM之间的细胞、转录组异质性的特征。
方法
- 下载GSE134355、GSE121893、 GSE145154的单细胞数据， GSE116250、GSE97358 、GSE5406 作为转录组数据验证。
- Seurat包单细胞降维聚类；FactoMineR包bulk转录组PCA聚类分析；
- DESeq2做差异分析，logFC取2，P＜0.05；
- clusterProfiler包评估差异标记基因，做GSEA分析心衰内皮细胞特异性标记基因和心肌纤维化相关基因鉴定富集，ReactomePA包ORA分析鉴定标记基因在HF中的Reactome通路。
- GSVA评估细胞活性。
结果
聚类标记marker
图1
下载GSE134355数据，在两个左室样本中筛出1324个和1480个细胞进行分析。t-SNE分析将两颗心脏的细胞分别聚为18个簇，scHCL法标注了两颗心脏的11种细胞类型。
图2
首先对GSE116250转录组中14个NF、37个DCM和13个ICM样本的PCA和差异表达分析显示，三组样品的表达模式存在显著差异(图2A,B)。其次对细胞类型的标记基因进行了GSEA，以检测这些标记基因是否聚集在ICM或DCM的上调或下调基因中。
在DCM和ICM的上调基因中，成纤维细胞和内皮细胞的标记基因显著富集(图2 C)，提示两种细胞的功能障碍可能都与DCM和ICM有关。
树突状细胞、M1/2巨噬细胞、中性粒细胞和平滑肌细胞的标记基因在ICM的上调基因中更特异性地富集(图2 C)。
这些结果表明，基于这些疾病相关细胞类型，DCM和ICM在心力衰竭发病机制上既有相似性又有特异性。
心竭内皮细胞和成纤维细胞中的关键调节因子
图3
HF可激活内皮细胞和成纤维细胞，因此对HF的内皮细胞和成纤维细胞中的关键调节因子做以探究，收集GSE121893 中NF、DCM和ICM样本左心室1082个内皮细胞scRNA-seq数据。将DCM和ICM样品与NF样品进行比较，发现HF内皮细胞的上调基因中内皮细胞特异性标记基因高度富集(图3A)。HF组织(bulk RNA-seq)和HF样本内皮细胞(scRNAseq)中，共有24个EC标记基因被发现上调(图3B)。富集分析发现炎症相关细胞粘附分子(CAMs)是参与HF发病的关键调控因子，包括CD74、HLA-B、HLA-E、HLA-DRB1、HLA-DQA1、HES1和CLDN5(图3C)。
图4
转化生长因子β1 (tgf - β1)是成纤维细胞活化的主要促纤维化因子。差异表达分析和GSEA一致发现TGFβ1诱导的心脏成纤维细胞中有很大一部分成纤维细胞标记基因上调(图4A)。在这些成纤维细胞标记中tgf - β1处理后，HF组织和成纤维细胞中29个基因也上调(图4B)。这些基因的功能表征表明，LTBP2、LTBP1、COL3A1、MFAP4、COL12A1、COL1A1、COL1A2、MMP2、TIMP2和PCOLCE2主要参与细胞外基质(ECM)组织和胶原的生物发生/形成/降解(图4C)。
综上所述，这些结果表明炎症相关的CAMs和ECM蛋白如胶原分别由内皮细胞和成纤维细胞特异性分泌，并可能在心衰期间诱导心脏炎症和纤维化。
趋化因子信号激活与ICM中较高的炎症相关
图5
随后估计免疫细胞活性。中性粒细胞和巨噬细胞在ICM中的活性明显高于DCM和NF(图5A)。与此一致，中性粒细胞和巨噬细胞的标记基因也在ICM中被特异性上调(图5B)。细胞间的通讯分析显示，自分泌配体-受体相互作用诱导中性粒细胞和巨噬细胞趋化因子信号激活可能是ICM免疫应答的原因(图5C)。
与DCM和正常对照相比，ICM中的配体CCL3、CCL4和受体CCR5特异性上调(图5D)。这些结果表明，ICM中较高的炎症可能与自分泌CCL3/CCL4 / CCR5相互作用诱导的趋化因子信号激活有关。
独立数据集中炎症相关CAMs、ECM基因和免疫反应的验证
图6
在GSE5406数据集中进行验证，炎症相关的CAMs如HLA-E、HLA-DQA1、HLA-DRB1和CD74以及所有ECM基因均上调(GSE121893，图6A)。独立的scRNA-seq数据集中，HF成纤维细胞中的ECM基因也上调了(图6B)。此外，与NF和DCM相比，ICM中的中性粒细胞和巨噬细胞活性似乎也更高，并且在验证数据集中也观察到ICM中自分泌配体受体对CCL3/CCL4 CCR5的上调(图6 C, D)。同样，CCL3和CCL4在ICM巨噬细胞中的表达高于DCM和正常心脏(图6 E)。
这些结果进一步表明，内皮细胞和成纤维细胞特异性分泌的炎症相关CAMs和ECM蛋白，以及中性粒细胞和巨噬细胞的趋化因子信号激活可能诱导心力衰竭时心脏炎症和纤维化。
结论
- 内皮细胞的标记基因在DCM和ICM中显著上调，表明内皮功能障碍可能与DCM和ICM都有关。相比之下，DC、M1/2巨噬细胞、中性粒细胞和平滑肌细胞在ICM中特异性上调，这是基于细胞亚群的生物标志物。
- 本文通过GSEA和差异表达分析发现HF中成纤维细胞标记基因的上调与心脏纤维化有关。在这些成纤维细胞标记基因中，29个在tgf-β1治疗的HF组织和成纤维细胞中也上调。
- 炎症相关的CAM和ECM蛋白分别由EC和成纤维细胞特异性分泌，并可能在HF进展过程中诱导心脏炎症和纤维化。ICM具有更特异性的免疫细胞类型，如巨噬细胞和DC。细胞间通讯分析显示，自分泌配体-受体相互作用诱导中性粒细胞和巨噬细胞趋化因子信号激活可能是ICM免疫应答的原因。
综上所述，ICM中较高的炎症可能与自分泌CCL3/CCL4-CCR5相互作用诱导的趋化因子信号激活有关。此外，与DCM相比，ICM中的中性粒细胞和巨噬细胞似乎也更高。
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