胎儿视网膜和干细胞来源的视网膜类器官的scATAC-seq发现细胞命运改变过程中的染色质变化

题目：Single-cell ATAC-seq of fetal human retina and stem-cell-derived retinal organoids shows changing chromatin landscapes during cell fate acquisition DOI：https://doi.org/10.1016/j.celrep.2021.110294

概述

拿到scATACseq数据可以做哪些分析呢？2022年发表在cell reports上的这篇文章或许可以参考下。文章对人胎儿视网膜和hESC来源的视网膜organoid进行了scATAC-seq，包括7个胎儿视网膜（其中2个在体外培养了4天）和5个organoid样本，根据年龄的不同，包含大约10-20个organoids。并和其他scRNAseq的数据进行整合分析。

文章主图：

• Fig1和Fig2:两个不同时期胎儿组织样本scATAC-seq的数据分析（包括降维聚类，不同细胞类型、不同marker基因的染色质开放性，细胞伪时序分化轨迹上 TF的motif富集程度）。
• Fig3已知视网膜发育过程很重要的基因OTX2和PTF1A在不同细胞类型中的染色质可及性不同（特定细胞类型中 染色质可及区域的变化）。
• Fig4 想看organoid多大程度和胚胎发育过程相似，比较了 organoid和胚胎来源培养的视网膜球（分群的不同、peaks的基因通路富集、和scRNAseq数据整合分析）。
• Fig5 和Fig6 分别看 Notch 信号通路抑制剂处理后，看胚胎来源培养的视网膜球和 organoid的染色质可及性变化（描述下Notch 抑制剂处理后的分群差异，chromatin landscape的变化，富集通路的不同，染色看标志marker差异）。

文章局限:

人胚胎视网膜组织的样本数比较少；整合分析的scRNAseq data是不同donor来源。

测序对象：

文章结论

胚胎发育早期染色质可及性

Fig1 早期细胞类型的识别和发育轨迹

这个阶段是分析孕8周（FW8）的胚胎视网膜数据。Fig1 主要展示了测序数据概览，用的是LSI和UMAP降维聚类。Fig1B'展示了每个cluster在特定marker基因位置的染色质可及性。如Fig1C，scATAC-seq数据中鉴定出的细胞类型和之前scRNAseq 鉴定的结果相一致。

鉴定细胞类型后，使用R包Chromvar探索每种细胞类型里开放染色质相关性最高的转录因子（TF） motif并对细胞进行伪时序排序（Fig1D）。Fig1E和Fig1F主要展示了 POU4F2和OTX2 motif在从MPC分化成RGC和感光细胞两个分支里富集程度。为了确定其他TF在每种细胞分化过程的重要性，我们对比并筛选了所有脊椎动物的 TF motif在不同lineage中的表。细胞按伪时序排列，并绘制出处于逐渐分化状态的细胞中 TF motif的相对富集情况。（图 E'和 F' 显示了moitf的相对丰度，E" 和 F" 展示了 RNA 表达）。Fig1E-E" 图中，随着细胞从MPC发展到 RGC，富含 Sox 家族 TF 的accessible区域变得越来越少；具有 E-box 结合 TF motif的区域也相应增加，包括 ATOH7、NEU-ROD1 和 ASCL1。在具有 E-box 结合 motif 的accessible位点初步增加之后，细胞中具有 POU4F2 motif的 accessible区域增加，随后具有 EBF1/2、ISLET1 和 ONE-CUT1/2 motif的accessible区域增加，这些motif是已知在 RGC 发育中很重要的 TF。Fig1F-F" 展示了从MPC到视锥细胞相似的分析。

胚胎发育晚期染色质可及性

Fig2 晚期细胞类型的识别和发育轨迹

这个阶段是分析FW13的数据。分析方法和FW8的数据类似（Fig2A-C），不过因为FW13的视网膜够大，样本能够分成两部分（如Fig2D可以分成中心和周边两部分）。关注到ONECUT1（一种已知对早期生成的细胞类型很重要的 TF）的motif，以示在人类发育的这一阶段，周边视网膜和中心视网膜的神经发生模式截然不同：含有大量 ONECUT1 motif peak 的细胞在中心视网膜的晚期生成细胞类型中不存在（图 2E，箭头所示）。Fig2F-F" 展示了视网膜中心muller glial基因的推定顺式调节区附近的 DNA 可及性发生了明显变化，如 RLBP1。

接着，研究者发现这个胚胎时期的视网膜中OTX2 RNA 的表达与accessible染色质中 OTX2 基因的相对丰度高度相关(Fig2H-J)。Fig2K 展示了不同细胞类型中以 OTX2 motif为中心的 Tn5 位点的基因组富集。Fig2L展示了视杆细胞伪时序排序过程中TF motif 的丰度分布和相关基因表达。与FW8样本类似，在FW13样本中从 MPC 状态出现的细胞也显示出 E-box 结合 TFs 的大量增加，如 NEUROD1 和 ASCL1。在杆系中细胞中，E-box 结合 TFs 之后是 RORB 和 OTX2 motif 的富集。此阶段，视网膜外周的 MPC 生成 HC，但在视网膜中央，HC 转向了星形细胞（AC）的生成(Fig 2M). 在 HC/AC 细胞群中，RBPJ motif的代表性相对较高的细胞数量有所增加（Fig 2N），同时含有 PTF1A 和 RBPJ motif peak的细胞数量也有所增加（Fig 2N'）。

scATAC-seq揭示出关键发育基因的调控网络

Fig3 调节人类胎儿视网膜中的 OTX2 和 PTF1A

与前面报道相一致，我们发现 了DHS4 确实是在 NPre和P/Bpre 细胞中显示出初始可及性的peak（Fig 3A 和3B，箭头所示），而其他DHS基因在可识别为感光细胞的细胞中变得可及（Fig3A、3B'和3B"）。而且，DHS4 中存在 Ascl1 的motif（Fig 3A）。将先前确定的 OTX2 调节区域解析为特定细胞状态的能力为确定这些调节区域所在序列提供了一种高分辨率方法（Fig 3C）。我们发现了PTF1A 基因（一个抑制性神经元 HC/AC发育的关键因子）附近的可能存在的几个顺式调控区域(AR1-12)（Fig 3D）。一些AR区域在不同细胞类型表现不一样，比如AR4,AR2,AR8（Fig 3E,E",E'）.

视网膜organoid的染色质可及性

Fig4 organoid和视网膜球(reinospheres)的比较

organoid 里的细胞群和胚胎样本中的很相似。且与胚胎来源培养了4天的视网膜球样本进行整合时（Fig 4A），我们发现开放染色质的模式非常相似（Fig4B）。当我们比较不同样本中所有细胞的所有peak时（Fig 4C），我们发现两者之间存在统计学意义上的显著相关性（p < 0.0001），R2 系数为 0.85。不同的地方见Fig4C', Fig4C".

接着分析比较了我们组之前发表的scRNAseq数据 , NOTCH信号通路的组分在organoid中表达很低 (Fig4D), AC和HC 的细胞数量在organoid中有降低 (Fig4E-F)。在ATACseq数据中，年龄匹配的胎儿视网膜球相比，器官组织中 AC/HC 系细胞的比例差异虽小，但却一致，且而 OTX2+ 系细胞的增加幅度更大。(Fig4F)。PTF1A 可及区域在两类样本之间也显示出差异 (Fig 4G)。

抑制 Notch 后视网膜细胞染色质可及性的重组

Fig5 胎儿视网膜中添加 Notch 抑制剂后染色质landscape的变化

使用的是FW11+4DIV，分析Notch信号通路抑制剂处理前后的不同之处(Fig5A-C )。抑制剂处理后， NPre细胞的数量变多(Fig5A-C )；开放染色质的从 MPC 状态到 NPre 状态有个比较大的shift (Fig5C-E). 感光细胞分支的增加伴随着H/Apre 分支的降低(Fig5D, 5F).

使用GREAT包进一步分析发现，抑制Notch信号通路后，开放的染色质上的peaks富集在'neuron differen- tiation', 'axonogenesis' 和 'cell fate commitment'等信号通路中。染色质可及性增加的基因主要在‘eye morphogenesis' 通路中，包括NR2E3，PRDM1，TULP1，感光基因，VSX1，PROX1，FOXN4 (Fig 5G-5G")

接着用实验验证，Notch抑制导致用OTX2抗体标记的视网膜细胞比例迅速增加（24小时）（Fig 5H, 5I）。我们在Notch抑制前用EdU标记了一组祖细胞，以追踪10天后Notch抑制对细胞命运的影响。我们发现，与对照组相比，Notch抑制引导祖细胞主要分化为OTX2+神经元，并减少了HuC/D+ AC的数量（Fig 5J, 5K）。Notch抑制后细胞命运获得偏离抑制性神经元系（如HC和AC命运）的现象反映在PTF1A基因附近的一些假定顺式调控峰的减少上（Fig 5L），表明这种效应发生在该系的早期。

Fig6 视网膜organoid添加 Notch 抑制剂后染色质开放性的变化

接着又在视网膜organoid中检测Notch抑制剂的作用。抑制剂处理后，NPres 增加，同时 MPCs 减少，这与我们在胎儿样本中发现的情况类似，但影响程度大大降低(FigA-C,C')。其他一些基因的开放性与胎儿组织中观察到结果类似(Fig 6E,6E',6F, 6F'),但影响幅度降低。但是延长抑制剂的处理时间后，影响幅度增加(Fig 6H)。

往期回顾

Bulk和scRNA-seq的综合分析揭示与心力衰竭相关的细胞类型

初探单细胞下游

duplicated是重复的reads，那deduplicated又是什么？

cellranger定量结果详解

癌症相关成纤维的多个单细胞亚群肯定是细胞状态而不是细胞类型