单细胞分辨率下鉴定中胚层诱导的 ESC 中的转录组学、调控网络和增强子

简介

题目：Transcriptomics, regulatory syntax, and enhancer identification in mesoderm-induced ESCs at single-cell resolution DOI:10.1016/j.celrep.2022.111219

2022年发表在 cell reports上的文章。文章用ESC分化成肌肉细胞的模型，探讨在细胞分化过程中的表观变化。

文章图表：

• Fig1: 对 Bmp4 处理和control组ESC 的转录组、增强子和染色质可及性进行bulk和单细胞分析
• Fig2: 对Pax3-GFP ECs进行scRNAseq和scATAC-seq
• Fig3: 对ESCs来源的不同细胞系进行scRNAseq和scATAC-seq
• Fig4: 鉴定并表征调控Pax7 表达的基因组区域

小结： 对于ESC分化的不同时期进行多组学测序，看分化过程的调控因子。找到其中的一个基因，并用实验证实了具体的enhancer存在区域。思路简洁明了。

结果

1 Bmp4处理后ESC的变化

Bmp4主要用来进行mesoderm的形成(Bmp4处理：instructed；未处理：naive)。Fig1B-F展示的是对两组细胞RNAseq分析结果。Fig1D-F 看到，与干细胞多能性相关的基因如Nanog, Esrrb, Klf4, Prdm14, Tbx3和Zfp42在ESC 中下调。也就是，Bmp4处理的ESC细胞多能性下降。

Fig1G-1H 展示了ATAC-seq结果：68%的基因在转录起始位点（TSS）富集，其染色质可及性增加。H3K4me1和H3K7ac ChIP-seq后并和ATAC-seq结果整合分析，发现增强子在不同处理组被激活的程度不同(Fig1J - L)。

接着对两组细胞进行单细胞多组学测序(Fig1M - N)。未处理的ESC中的cluster1 高表达干性相关基因。Pioneer factors 如GATA4聚集在Bmp4处理ESC的cluster4(Fig1O-P)。

Fig1: 对 Bmp4 处理和control组ESC 的转录组、增强子和染色质可及性进行bulk和单细胞分析

2 对PAX3-GFP ESC进行单细胞多组学分析

对ESC换一种条件(更易获得aPSM命运) 培养96h后，Pax3-GFP开始表达(Fig2A-B)。用FACS分选GFP+细胞后进行scRNAseq和scATAC-seq,聚类分群分析结果见Fig2C-E. cluster3表达内皮细胞相关基因(Fig2F),cluster2表达糖酵解和神经相关marker(Fig2G, H). Sox2在两组ESC中的cluster2都高表达(Fig2I)。Fig2J-K展示了Sox2在两组细胞中的不同调控区域。

Fig2: 对Pax3-GFP ECs进行scRNAseq和scATAC-seq

3 对ESC来源的不同细胞进行多组学测序分析

对ESC再换一次培养液培养48h后，进行单细胞多组学测序。Fig3 展示了分析结果。包括聚类、分化轨迹分析。Ascl1和Nhlh1表达量的分析、DNA结合motif的分析。一番分析后，得到的结论是：myofenic cluster可能复现体内的骨骼肌形成：Pax7+/Myod1+的MuSCs细胞在维持Myod1表达的同时逐渐降低Pax7（激活的MuSCs和增殖的肌母细胞，Pax7-/Myod1+），开始分化（肌细胞，Pax7-/Myod1+/Myogenin+），并最终分化（Myod1-/Myogenin-/Tnnt3+）。

Fig3: 对ESCs来源的不同细胞系进行scRNAseq和scATAC-seq

4 鉴定并表征调控Pax7 表达的基因组区域

Fig4A中能看到，相比较ESC，aPSM细胞中Pax7的 染色质可及性增加。scATAC-seq 发现了一个主要的 aPSM 细胞群（cluster0）,该细胞群在与前/后模式规范和体细胞发生相关的基因上显示出优先染色质可及性(Fig4B). Pax7只在HIFLR 中具有可及性(Fig4C).在 aPSM 和 HIFLR 细胞中，En7 region与 Pax7 启动子区域相互作用（Fig4D).对不同位点进行敲除发现，En7的敲除降低了Pax7点相互作用水平(Fig4E)。将这个En7 enhancer的区域克隆到荧光素酶报告系统中，与对照组相比，En7能够激活荧光素酶活性(Fig4F);En7 区域敲除后，Pax7表达降低70%(Fig4G)。细胞内的实验进一步证实En7区域的作用(Fig4H-I )。

Fig4: 鉴定并表征调控Pax7 表达的基因组区域

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