Libra：单细胞差异分析算法的全家桶
前言
相对于传统的bulk RNA-seq，scRNA-seq的特色就是为了找出更细微的差异，而单细胞数据分析的最终目的就是基于一系列差异分析，鉴定出和生物学表型相关的差异。因此，分析过单细胞数据的小伙伴想一下不难得出，所有高级分析都是基于找出的差异基因扩展的，它们的第一步都是算出组间的差异基因，然后做拟时序分析，细胞通讯分析等。
因此，在相应的scRNA-seq情形下选择合适的差异分析算法，对得到准确的生物学解释至关重要。Immugent今天要介绍的主角--Libra，就是一个专注于差异分析的R包，用于一站式解决所有scRNA-seq差异分析。正如作者所介绍的，开发这个包的灵感来源于之前Seurat和Muscat包（muscat：专注于多样本多分组的单细胞差异分析），但是这两个包都是从不同的单一角度着手，虽各有所长，但适用场景有限。而Libra着手于解决一站式解决scRNA-seq差异分析，其总共集成了22种不同的差异分析算法，这些方法都可以从一个函数中访问，其中包括传统的单细胞方法以及包括pseudobulk和mixed model方法在内的所有主流算法。
主要内容
scRNA-seq差异分析面临的挑战
在正式讲Libra之前，Immugent先概述一下目前scRNA-seq差异分析面临的主要挑战：
1.数据稀疏性和噪声：单细胞测序技术通常会导致数据的稀疏性和噪声。每个细胞的RNA分子数量很少，因此很多基因在某些细胞中可能没有检测到表达，导致数据矩阵稀疏。此外，测序技术的限制和实验误差可能引入噪声，影响分析的准确性。
2.批次效应和技术变异：单细胞测序可能受到批次效应和技术变异的影响，这可能是由于实验条件、测序平台、处理流程等因素引起的。这些因素可能掩盖了真实的生物学差异，需要进行有效的批次效应校正和技术变异处理。
3.细胞异质性：单细胞样本通常包含多种类型的细胞，甚至在同一类型细胞中也可能存在多样性。这种细胞异质性可能导致在分析中掩盖真实的差异信号，需要采取措施来识别和处理这种异质性。
4.细胞数量不平衡：在某些情况下，不同组别或条件下的细胞数量可能不平衡，这可能导致在差异分析中的偏见，需要进行适当的均衡和配对。
5.细胞状态漂移：细胞在不同的条件下可能会发生状态漂移，即细胞的表达模式在时间或环境变化中发生变化。这可能模糊了不同条件之间的差异，需要考虑如何对漂移进行建模和校正。
6.统计方法的选择：单细胞数据的特殊性要求开发适用于单细胞数据的统计方法。选择合适的差异分析方法对于准确地检测差异是至关重要的。
7.数据维度高：单细胞数据通常具有高维度，即每个细胞可能表达数千个基因。高维数据分析可能需要采用降维技术，以便于可视化和分析。
Libra集成目前所有主流差异分析算法
为了更好的提高scRNA-seq差异分析的准确性，目前各个领域的科研工作者开发了一些列的算法。Libra在集成了这些算法后，其主要通run_de函数将一个预处理的单元特征(例如，scRNA-seq的基因)矩阵和一个包含与每个单元关联的分类信息作为输入，也就是需要表达矩阵和meta分组信息。
因此，在使用Libra时，研究者应该在所有实验条件下对数据进行预处理(例如，通过读取对齐和scRNA-seq的单元类型分配)。特别值得一提的是，Libra提供了一个通用接口，使用22种离散方法执行不同的scRNA-seq差异分析算法。这些方法总结如下:
从上面的表可以看出Libra几乎整合了目前所有差异分析算法，下面是Libra包的安装代码。
if (!requireNamespace("BiocManager", quietly = TRUE))
install.packages("BiocManager")
BiocManager::install(c("edgeR", "DESeq2", "limma"))
install.packages("Seurat")
devtools::install_github("neurorestore/Libra")
计算delta variance评估差异分析结果
在相同的实验条件下，如果能重复出基因表达的内在差异是最理想的，这反映了生物学事件的可重复性。同样的，对于数据分析来说，能够在不同批次得到的数据中得到相近的差异分析结果，也是对差异分析算法的最高要求。
然而，如果不能解释这些差异，可能会导致方法将生物学重复实验之间的固有可变性错误地归因于扰动的影响。为了研究这种可能性，Libra的作者在最后比较了每个基因在pseudobulks和pseudo-replicates中的表达差异。作者称之为“delta方差”，使用者可以使用delta方差的计算来通知他们的差异表达结果。例如，通过不考虑生物复制的方法(即“单细胞”方法)识别出的差异表达基因应该谨慎处理，因为它们很可能是假阳性。Delta方差的计算方法为:
DV = calculate_delta_variance(hagai_toy)
通过运行该函数，将返回一个向量列表，每个向量对应一个细胞类型，每个向量包含输入表达矩阵中存在的基因的增量方差（小声哔哔，Immugent自己不是很懂）。
Libra包虽然囊括了众多差异分析算法，但仍只是一个scRNA-seq差异分析的集成器，其并没有开发出新的算法。因此，未来仍然需要更强健的scRNA-seq差异分析算法，可以在以下几个方向上得到进一步的发展和完善：
1.更精确的差异检测方法：当前的单细胞差异分析方法通常基于基因表达的统计分析，但由于单细胞数据的噪音和稀疏性，存在假阳性和假阴性的问题。未来的发展将集中在开发更精确的差异检测方法，考虑到单细胞数据的特点，减少错误发现。
2.单细胞亚群间差异分析：单细胞测序数据可能包含不同细胞亚群，这些亚群在功能和表达特征上有所不同。未来的发展方向将涉及开发针对亚群间差异的方法，帮助揭示在不同细胞状态下的亚群差异。
3.动态变化的分析：随着单细胞数据的发展，越来越多的研究关注细胞在不同时间点或条件下的动态变化。未来的算法发展将专注于识别和分析这些动态变化，揭示细胞状态转变和发育过程中的关键基因和通路。
4.整合多组学数据：细胞的功能和状态不仅仅由基因表达决定，还受到其他因素（如蛋白质表达、表观遗传学等）的影响。未来的发展将包括整合多组学数据进行差异分析，以获得更全面的信息。
5.网络和通路分析：单细胞数据的差异分析不仅仅是基因层面的，还可以涉及到基因网络和通路的变化。未来的发展方向将包括开发能够在网络和通路水平上进行差异分析的方法，以更好地理解细胞功能的变化。
6.单细胞空间信息的整合：随着空间转录组学技术的发展，细胞在组织中的位置信息与其基因表达信息相关联。未来的发展将关注如何将单细胞空间信息整合到差异分析中，以深入理解组织内不同区域的细胞差异。
7.机器学习和深度学习的应用：机器学习和深度学习方法在单细胞数据分析中有巨大的潜力。未来的发展将探索如何利用这些方法来更好地处理单细胞差异分析问题，从而更好地挖掘数据中的模式和关联。
8.跨样本和跨实验的整合：将来，会有更多的单细胞数据涉及跨样本和跨实验的比较。算法的发展将重点关注如何在不同条件下进行差异分析，并有效地整合和比较结果。
未来单细胞测序数据差异分析算法将朝着更精确、更全面、更适应动态变化和空间信息的方向发展，同时结合机器学习和深度学习等技术，以更好地揭示细胞的功能和状态差异。
- https://github.com/neurorestore/Libra
- https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2021.03.12.435024v1
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