Nat. Rev. Drug. Discov. | 以小分子靶向RNA结构

今天为大家介绍的是来Robert T. Batey 和Matthew D. Disney的一篇关于靶向RNA小分子的论文。RNA在人类生物学中是3D形态，赋予不同的功能角色，并在疾病中导致功能障碍。目前正在积极追求利用小分子治疗性地靶向RNA结构的方法，其中包括预测进化保守的RNA结构的计算工具的发展，以及扩展作用方式并促进与细胞机制的相互作用的策略。现有的RNA靶向小分子使用一系列机制，包括通过与细胞蛋白作为分子黏合剂来定向剪接，抑制难以药物化的蛋白质的翻译和停用非编码RNA中的功能结构。在这里，作者描述了识别、验证和优化靶向功能转录组的小分子的策略，为将这些药物推进到未来十年制定了路线图。

RNA作为治疗干预的靶点的第一个证据来自1944年链霉素的发现，随后鉴定了细菌核糖体，一种大分子的RNA-蛋白质复合物，作为这种天然产物的细胞靶标。20年后，首次报告了人类第一个核酸序列和RNA结构 - 携带丙氨酸的tRNA（tRNAAla），进一步揭示了tRNA在翻译中的作用，其3D折叠结构在氨酰化和mRNA序列解码为蛋白质中起着关键作用。催化RNA的发现扩展了RNA的化学功能，远远超出了编码蛋白质和解码mRNA的范围。

人类基因组的序列进一步加强了RNA在生物学中的贡献，观察到的ORFs远少于预期。事实上，生物体复杂性与ORF的数量无关，而与非编码（nc）RNA的数量和多样性相关，这些RNA在表观遗传调控和基因表达调节中发挥功能，特别是在发育过程中。此外，全基因组关联研究（GWAS）已经定义了在疾病中发生异常调节的生物途径，阐明了潜在的治疗靶点，包括RNA和蛋白质。这些数据可以用于实现从实验室到临床的模式，在该模式中，小分子可以与结构化的RNA结合并使其失活：患者的基因组可以进行测序，并与GWAS进行比较，以确定发生故障的RNA。有针对性的治疗将结合RNA中的功能结构，以绕过疾病途径。

有望用于靶向RNA的治疗策略包括反义寡核苷酸（ASOs）、CRISPR基因编辑以及能够识别RNA结构的小分子。ASOs和CRISPR编辑在化学生物学领域中非常有价值。然而，将这些技术转化到临床应用中一直是一个挑战，因为存在难以逾越的药物传递问题和严重的不良反应。小分子提供了一个重要的替代方案，具有可能通过口服途径进入体内并突破血脑屏障，特别是在药物化学领域积累了大量的知识，可以系统优化药物的物理化学性质以改善药代动力学和效力。

已经鉴定出几种结合RNA结构的小分子，它们表现出不同的作用方式（MOAs），从简单的结合到直接剪切再到招募内源核酸酶（诱导近距离作用）。这些分子已被证明可以调节各种生物过程，例如抑制细菌和病毒的翻译；抑制mRNA的翻译；促进可选择的前mRNA剪接；抑制microRNA（miRNA）的生物合成。

RNA结构确定

准确的RNA结构模型是设计或发现调节其功能的小分子的关键。计算方法可以从序列模拟RNA结构，包括自由能最小化和系统发育比较。自由能最小化使用实验得到的热力学参数来预测RNA结构，输出最小自由能结构，被假定为功能结构，以及次优结构。RNA结构的总自由能通过对系统中每个亚结构（如碱基对、突起和环）的自由能求和来计算。未配对的核苷酸可以通过化学修饰在体外和体内进行鉴定。化学修饰会使反转录酶（RT）停顿，导致cDNA截断（称为“RT stop”），或者引发一种突变，这两种情况都可以通过高通量测序进行读出。这些修饰位点限制了次级结构预测，其中修饰程度与核苷酸成对的能量惩罚相关。转录组范围内的DMS和SHAPE探测技术极大地扩展了细胞中整体RNA结构特征的知识，并使得在不同生物条件下研究RNA构象变化成为可能。系统发育比较也可以揭示RNA结构的信息，通过保留二级结构的遗传差异，可以阐明RNA的结构，而保守性则暗示着保持功能结构的选择性压力。通过与晶体结构比较，基于共变的结构预测对许多RNA结构是非常准确的。然而，由于所需的大规模数据集和分析的复杂性，自动化的基于共变的预测方法仍然具有挑战性。系统发育比较已与其他预测方法相结合，无论是在序列或共同处理中，包括同源建模、自由能最小化和化学修饰，以提高准确性，这依赖于比对的质量和序列的可用性。

RNA的折叠是分层的，可以形成三级结构。关于RNA的三维结构的信息对于揭示RNA的功能机制和识别可靶向的靶点非常有价值。虽然与蛋白质的三维预测方法相比，目前可用的三维预测程序还处于初期阶段，包括FARFAR2、MC-Fold/MC-Sym和iFoldRNA，已经显示出了从序列预测三维结构的有希望的结果。还开发了估计预测结果准确性的评分函数，其中未知的原生结构，如Rosetta、RASP和ARES。随着机器学习技术的实施，ARES表现优于其他两种方法。将预测结构与已知晶体结构进行均方根偏差分析表明了该方法的效力。

图 1

许多算法已被开发用于预测RNA的结构。然而，在没有已知结构的情况下，很难评估预测的可靠性和准确性，这个问题已经通过开发各种统计方法来解决。分区函数计算已被纳入各种结构预测程序中，包括RNAfold，Sfold和CONTRAfold。分区函数包含系统的所有热力学信息，并量化了其中预测结构或亚结构的概率。统计方法也已应用于系统发育比较，如R-scape，它测量了系统发育相互作用的统计显著性，表明其功能性。虽然R-scape改进了从Rfam数据库中的5S rRNA中的共识结构的注释，但在长非编码（lnc）RNA HOX反义间隔RNA（HOTAIR）、类固醇受体RNA激活剂（SRA）或X-不活性特异性转录本（Xist）中并未发现显著的共变性，虽然其他计算方法已经预测了合理的结构。这些lncRNA中缺乏功能性结构并不是由于系统发育树的变异缺失，也不意味着这些lncRNA不折叠。相反，它们可能形成在其他相互作用伴侣的背景下稳定的动态结构，强调了了解预测方法的局限性和实验验证的重要性。

理想情况下，小分子药物应该对其RNA靶点完全具有选择性，但实际上可能并不需要或者甚至无法做到完全选择性。历史上，由于RNA被认为缺乏结构多样性（只有四种构建单元），其带负电的骨架，以及在高通量筛选中取得的成果不尽如人意，因此认为小分子对RNA的选择性识别是难以解决的。随着我们对可靶向的RNA结构和与RNA结合的化合物的基本认识的不断发展，以及RNA结构建模的进步，我们对RNA结构的功能有了更深入的了解。结合的选择性和功能选择性是不同的。已经确定了多种因素，驱动了针对RNA的配体在细胞内的功能选择性，包括目标在转录组中结构的独特性，与非靶标的相对亲和力，靶标位点的可及性和结合位点的功能性。关于目标表达，如果两个或更多的RNA具有相同的结合位点，则目标表达较高的将更多地被化合物占据。同样，如果两个或更多的RNA具有可被同一化合物结合的不同结构，则最多被占据的目标将是相对亲和力和表达水平的复合体。在选择性不足的情况下，可以设计同时靶向RNA靶点内多个位点的化合物，从而克服结构退化（结构在转录组中不唯一）的局限性。已经进行了涵盖整个转录组和蛋白组的研究，以深入了解RNA靶向小分子的选择性。这些研究显示小分子可以在转录组和蛋白组上产生选择性效应。值得注意的是，观察到的变化和选择性与寡核苷酸靶向小分子类似。一种类似于FDA批准的药物risdiplam的类似物，其结合到RNA-蛋白复合体而不仅仅是RNA，具有选择性，可以改变11174个转录本的水平，以及改变部分mRNA的可变剪接，包括所需的目标。就像针对蛋白质的小分子一样，针对RNA的小分子的非靶标可能是其他RNA、DNA或蛋白质。到目前为止，与绑定蛋白质的小分子相比，与RNA结合的骨架似乎是不同的，这也表明了在针对蛋白质的小分子库中找不到选择性RNA结合剂的失败。

识别结合位点

可以使用多种方法在体外寻找与RNA结构结合的小分子，包括基于荧光的检测方法，荧光共振能量转移（FRET）基础的方法以及动态组合筛选。下面描述的方法都是以目标为中心的，也就是说，小分子的结合选择仅限于单个或少数几个目标。与任何一种初筛检测方法一样，需要进行二次分析以确定选择性结合剂。对于下面描述的所有荧光检测方法，必须注意，因为许多化合物可能与染料本身发生相互作用，或者其发射性能可能与荧光体重叠。

图 2

亲和选择质谱（AS-MS）是一种无标记的方法，它允许通过质谱直接鉴定靶标-配体复合物，并通过分子量排阻色谱将非结合的配体与之分离。该方法在蛋白质研究中得到广泛应用，但最近才开始用于RNA靶标的研究。AS-MS的一个变体称为自动化配体鉴定系统（ALIS），它使用间接检测目标-配体相互作用的方法，通过在液相色谱-质谱（LC-MS）分析前解离形成的复合物来识别结合的配体，如图2a。

基于荧光的测定方法。另一种高通量的测定方法是通过感兴趣的小分子来置换荧光染料或化合物。虽然最初用于研究DNA结构的结合，但也已被应用于RNA靶标，通过置换荧光染料TO-PRO-1 (图2b)，以及其他方法。这种染料置换方法的扩展是一种开启荧光的测定方法，使用已知的荧光或标记的结合小分子与带有猝灭剂的感兴趣的RNA结合（图2b）。还可以通过将腺嘌呤残基替换为荧光模拟物2-氨基嘌呤（2-AP）来评估小分子的结合。2-AP的荧光取决于其微环境，在与小分子结合时发生变化（图2b）。这种2-AP测定最初用于研究氨基糖苷类抗生素与细菌rRNA的结合及其对A位点动态的影响，但已扩展到其他靶标。值得注意的是，应谨慎选择2-AP在RNA内的替换位置，以确保获得强信号。

小分子微阵列（SMMs）通过在玻璃片上以空间阵列的方式提供微量化合物，最初用于检测蛋白质结合，后来扩展到研究氨基糖苷类抗生素与rRNA A位点的结合以及氨基糖苷类抗生素的修饰如何受到耐药酶的影响。SMMs现已用于筛选各种化合物和RNA靶标（图2c）。SMMs的一个优点是只需要少量小分子即可完成筛选，并且可以同时对成千上万个相互作用进行分析。化合物通常被共价地固定在阵列上。值得注意的是，与溶液中的结合相比，与表面的结合可能会有很大的不同。小分子也可以通过吸附的方式非共价地附着在琼脂糖包被的微阵列表面上。

碎片法药物发现利用低分子量化合物库高效地探索可能与目标结合的化学空间（图2d）。虽然可以通过核磁共振（NMR）光谱等方法对碎片进行筛选，例如通过NMR光谱鉴定与SARS-CoV-）结合的碎片，但这些相互作用通常很难检测，因为它们的亲和力低且停留时间短。为了克服这些限制，小分子碎片已经被功能化为光亲和基团（完全功能化的碎片；FFFs），使其能够捕获和鉴定结合的靶标。

DNA编码化合物库（DEL）技术是一种强大的方法，用于探索在溶液中或固相上与目标生物分子结合的化学空间。DEL是通过分裂和混合的迭代过程在珠子上合成的，其中多个建筑块之一与珠子共轭，并且其身份被编码在连接到珠子的短DNA标签中。功能化化合物的珠子通常在荧光标记的目标存在的情况下进行结合筛选，通常在与差异标记的非靶标共存的情况下进行（图2e）。对于RNA靶标，可以通过使用已经发生突变的RNA来完成对比筛选，类似于结合分析的突变（图2e）。

设计小分子RNA结合物

与其对化学物质进行筛选，小分子RNA结合物的设计采用基于选择的方法，来定义RNA结合小分子的首选靶标和基于结构的设计。

一种选择性平台，2D组合筛选（2DCS），用于定义小分子RNA结合物的结合位点。小分子显示在微阵列上，从一个显示具有离散次级结构模式的随机区域的RNA库中选择其首选RNA配体。选择实验在存在大量竞争性寡核苷酸的严格条件下进行，这些竞争性寡核苷酸模仿库中所有成员共有的区域，将结合相互作用限制在随机区域。常常使用完全配对的DNA和RNA寡核苷酸竞争体或tRNA来增加选择的严格性。选择的RNA通过RNA测序进行分析，随后通过对RNA与小分子富集的严格统计分析。统计学显著性与亲和力成正比，因此RNA富集程度越显著，其与小分子的结合越紧密。这种分析为每个小分子提供了一个结合位点或分子指纹，其中具有选择性的小分子只有少数RNA具有统计显著富集，而具有多个RNA富集的则是多样的。这些结合位点为小分子提供了理想的靶标和潜在的非靶标。可以通过计算地比较细胞RNA靶标与这些分子指纹，来为小分子设计提供信息，如在导向识别策略Inforna中所示（图2f）。

首先应用于蛋白质靶标，基于结构的设计和分子对接已经实现了对RNA靶标的先导化合物的发现和优化（图2g）。通过使用明确定义的RNA结构，通常是通过NMR光谱解析得到的，可以设计小分子适应结合口袋。此外，NMR研究还可以在计算上预测RNA构象的动态集合，包括短暂的、非功能性的种类。然后，可以将小分子库对接到这些集合中，在计算机中筛选选择性结合RNA的小分子。这些方法的显著局限性在于RNA结构的质量，因为通过NMR光谱很难生成高精度的结构，以及分子对接程序本身。有趣的是，最近发展了一种NMR方法来研究HIV-1 TAR和Rev响应元素（RRE）RNA中的构象偏好。对每个RNA进行了一系列突变，并通过NMR光谱测定构象平衡的效应。这些光谱研究可以估计RNA以非功能性结构折叠的百分比，通过研究RNA突变体的细胞活性进行验证。

表型筛选是一种识别影响与特定表型相关的通路的化合物的策略，因此不需要对药理作用机制（MOA）或靶标有任何了解。这些测定在生物过程周围设计了筛选，例如，选择性前mRNA剪切，翻译抑制，蛋白靶标的解抑制和细菌生长。在哺乳动物细胞中完成的测定通常使用荧光素酶或荧光蛋白作为输出。两种调节剪切的小分子已经通过表型筛选发现，即FDA批准的risdiplam和正在进行II期临床试验的branaplam，用于治疗脊髓肌肉萎缩症（SMA）。尽管表型筛选已经取得了成功，但仍然存在一些挑战，主要是因为该方法是无靶标的。

RNA靶向小分子的靶标验证和选择性

图 3

直接靶标结合是定义化合物机制的关键。以下作者描述了基于小分子与RNA靶标之间的共价键形成、RNA靶标的切割以及耐药性分析的各种靶标验证方法。除了耐药性分析，这些方法可以在体外、细胞内或体内研究靶标结合。

幸运的是，有些方法不仅可以评估所需靶标的结合，还可以测量选择性。在此，作者再次指出结合选择性和功能选择性之间的区别。结合选择性通常是通过在小分子的结合位点模型中引入点突变来在体外测量的，它衡量相对亲和力，从而衡量靶标的占有程度。大多数目标RNA中的结构的结合对生物学没有功能影响。相比之下，功能选择性衡量靶标结合是否产生生物学效应，即通过靶标下游途径的变化和相关表型来评估RNA的功能是否被调控。

耐药性分析对细菌或病毒基因组施加选择性压力，诱导发生突变以获得耐药性（图3a）。对耐药株的基因组进行测序，以确定哪些基因发生了突变，从而确定化合物的靶标。与基于共价键和切割的靶标验证方法相比，耐药性突变分析不需要合成化学探针，整体上实验步骤较少。然而，这需要小分子施加足够的进化压力来诱导耐药性突变，在癌症生物学中经常使用该方法。

细胞靶标验证方法针对RNA近期得到了发展，其中一种基于与靶标的共价键形成的方法，或者对靶标的切割。其中一种共价方法是化学交联和下拉分离（Chem- CLIP；图3b），于2013年发展起来，它依赖于对小分子进行功能修饰，附加一个交联模块和一个纯化处理器。RNA结合模块促使目标的参与，使交联模块接近RNA，从而它们可以直接反应或在辐照后反应。小分子-靶标复合物通过珠子被捕获和纯化。可以使用定量PCR与反转录）或RNA- seq和随后的统计分析来分析在拉下的分数中RNA靶标的富集，与起始裂解物进行比较。

还发展了相互补充的细胞靶标验证策略，这些策略依赖于RNA靶标的竞争性切割，包括ASO- Bind- Map（图3c）和与RNA降解剂的竞争（图3d）。在ASO- Bind- Map中，一个与目标RNA序列互补的ASO gapmer与一个结构结合的小分子竞争结合。在没有小分子的情况下，ASO通过核糖核酸酶（RNase）H诱导切割，导致目标RNA的丰度降低。如果一个小分子结合到同一区域，它将妨碍ASO的杂交，从而减少目标RNA的消耗。这种策略的灵感来自使用ASO探测RNA折叠的研究，在这种研究中，快速折叠成稳定结构的RNA区域对ASO杂交的可及性较低。如果怀疑存在脱靶靶点，ASO- Bind- Map可以证实或否认靶标的参与。还开发了一些方法，其中小分子直接切割RNA靶标或招募核酸酶来实现切割，通过RNA- seq分析鉴定靶标和脱靶靶点。这些方法类似于ASO。为了直接切割RNA靶标，一种被称为小分子核酸剖析技术应用于RNA（RiboSNAP）的方法，使用了与天然产物苯并苝霉素（bleomycin）结合的先导分子。苯并苝霉素通过金属离子和氧化过程引发DNA和RNA的链断裂。苯并苝霉素A5通常通过其末端胺基结合，这驱动其对DNA的亲和力；对胺基进行烷基化可以减少共轭物对DNA的损伤，并将其活性定向到RNA靶标。

优化先导物

图 4

结构导向的优化方法依赖于复杂的配体- RNA复合物模型，以定义关键的相互作用并确定化合物结构中的位置如何进行修改以改善相互作用或消除不利的相互作用（图4b）。这些模型通常通过NMR谱学或X-射线晶体学实验生成。必须考虑RNA的动态特性，因为没有单一的静态结构能真正代表所有可能的构象。为了解决这个局限性，实验模型通常与分子动力学模拟相结合，生成结构的集合，其中算法根据实验确定的参数模拟RNA构象。基于分子动力学的虚拟筛选已经成功地发现了与各种RNA结合的配体，通常使用来自NMR谱学或X-射线晶体学的模型。由于这些结构未捕获RNA的动态性质，而分子动力学模拟也无法准确复制RNA静电效应，因此小分子配体的对接并不像可能的那样具有预测性。

小分子RNA结合剂的例子

图 5

许多RNA类具有功能性位点，例如miRNA前体中的Drosha和Dicer处理位点，病毒RNA中的IRES，以及一些人类mRNA中的功能性结构，细菌的核糖开关，剪接增强子和抑制子等。除了细菌核糖体外，非编码区域也被研究作为治疗HIV1和丙型肝炎病毒（HCV）等病毒感染的药物靶标。结构导向方法已被用于识别TAR RNA的新支架，该支架抑制了在细胞模型中由Tat介导的转录激活。其中一种支架，amiloride，后来通过优化得到了一个与入口化合物相比亲和力提高了100倍的类似物，并且其与RNA靶标的结构相互作用被很好地表征。丙型肝炎病毒（HCV）mRNA在其5' UTR中含有高度结构化且保守的IRES，它通过招募和组装宿主核糖体来启动翻译，并且可以被小分子结合所抑制。基于质谱的筛选识别了2-氨基苯并咪唑衍生物既是结合剂，也是HCV翻译抑制剂。在结构活性关系研究之后，这种引物的亲和力提高了约100倍。

发现一种靶向II类内含子的抗真菌剂。II类内含子是一类自体剪接核糖酶，在真菌和酵母的线粒体中发现，但在哺乳动物中不存在，因此它们可能是抗真菌剂开发的理想靶标。对大约10,000种化合物进行II类内含子剪接抑制剂的体外筛选，得到了六个引物，作为起点进行了研究。通过SAR研究得到了药理学分析，提供了改进了物理化学性质的另类支架，最终得到了与两性霉素B具有相当抗真菌活性的低微摩尔水平II类内含子剪接抑制剂。

miRNAs是由20-25个核苷酸组成的小非编码RNA，在转录后调节基因表达中起关键作用，通过与Argonaute RNA诱导的沉默复合物（RISC）结合，并与互补mRNAs的3' UTR进行碱基配对来沉默基因表达。miRNAs由RNA聚合酶II转录为初级转录本（primiRNAs），它们经过逐步处理，首先由核酸酶Drosha处理为前体miRNA（pre-miRNAs）；在导入细胞质后，由核酸酶Dicer产生成熟（功能性）miRNA。幸运的是，它们的结构可以根据序列进行准确建模，并且成熟miRNAs的深度测序可以推断出其处理（功能性）位点。许多研究表明Drosha或Dicer处理miRNA前体中的功能结构可以被靶向，从而减轻疾病。

已经发现了一些小分子RNA结合剂，可以选择性地抑制癌基因miRNAs的生物合成。其中一种鞘胺-胺基结合物（PA-1）是通过测量pre-miR-372处理的酶抑制活性而发现的见图5a。在体外实验中，这种未经优化的分子结合到pre-miR-372的Dicer位点，抑制了其处理，并通过解除其下游靶标大肿瘤抑制激酶2（LATS2）来减少癌细胞增殖。对小分子的选择性进行了miRnome全基因组研究，发现只影响了小部分miRNAs。这种结合物还减少了患者来源的癌症干细胞的肿瘤球体形成。后来对PA-1进行了优化，得到了选择性抑制pre-miR-372的小分子PA-3。

结论

随着RNA在健康和疾病中的功能不断扩展和多样化，RNA化学生物学领域也在不断发展，证明了RNA确实可以通过小分子进行药物化。此外，可以设计和优化RNA靶向的小分子，后者使用为蛋白质靶点开发的策略，并进行重要的修正和考虑。随着学术界和产业界共同推动这一领域的前沿发展，我们相信在未来几年中将会有更多的RNA靶向药物进入临床应用。

参考资料

Childs-Disney, J.L., Yang, X., Gibaut, Q.M.R. et al. Targeting RNA structures with small molecules. Nat Rev Drug Discov 21, 736–762 (2022).

https://doi.org/10.1038/s41573-022-00521-4