实验知识-230910

1.WB中β巯基乙醇作用是什么？

WB蛋白样本准备中最常用的是热变性（95-100℃，5min） ，并在加用上样缓冲液（loading buffer）。 Loading buffer分还原型和非还原型，还原型loading buffer多加有β-巯基乙醇等还原剂，能抑制或者破坏二硫键等的形成，能够更好地维持蛋白质的一二级结构。

2.PBS溶液是指磷酸缓冲液(Phosphate Buffer Solution)，渗透压近似于生理条件又有很强的pH缓冲能力，常用来洗细胞（不易涨裂）和作为细胞培养的基础液(pH缓冲)。

3.TBS缓冲液是生物学中常使用的等渗缓冲盐溶液，主要用于免疫组化和原位杂交，酶联免疫等实验中，清洗免疫印迹实验中非特异性结合的抗体等。由 Tris-HCl 构成稳定的 PH 缓冲体系，NaCl 提供等渗条件。

4.TBST缓冲液，即TBS with Tween-20，是生物学中常使用的等渗缓冲盐溶液，由Tris-HCl构成稳定的pH缓冲体系，NaCl提供等渗条件，Tween-20作为去污剂可增加缓冲液的洗脱能力。可应用于Western Blot实验中洗去膜上非特异性结合的抗体等试剂，以及免疫荧光、免疫组化等实验中封闭液的配制、一抗或二抗的配制、一抗或二抗孵育后的洗涤等，以降低背景，增强信噪比。所以一个是缓冲环境，一个是去污剂，不冲突。

5. 酸提法可以用来提取组蛋白，因为组蛋白是偏碱性的。操作步骤包括用一半体积的 TEB 洗涤细胞核，然后在0.2 N HCl中重悬沉淀，密度为每毫升 4 x 10 7 个细胞核，最后在 4℃ 下用酸法提取组蛋白过夜。需要注意的是，酸性提取法应用于植物细胞、黏菌和一些真菌时，可能会产生一种含有大量碳水化合物和多酚的组蛋白制剂，它们容易交联和氧化组蛋白3。如果想要发现新型PTMs，可以使用其他的组蛋白提取技术，比如高盐提。

6. loading buffer 的中文名字叫上样缓冲液，loading buffer的功能主要有两个。第一，里边的指示剂溴酚蓝和二甲苯氰FF起到指示的作用，显示电泳的进程，以便我们适时终止电泳；第二，里边的成分甘油可以加大样品密度，使样品密度大于TAE，从而沉降到点样孔中，防止样品飘出点样孔。另外，有的Buffer是加有SDS的，一般都会写明。SDS主要是促使聚合酶变性，因为没有除尽的聚合酶会结合在DNA双链上影响它的迁移速率。细胞裂解后的裂解液，加loading 100℃加热，也是为了中止酶促反应，防止提取的蛋白质降解。

7. 直接用做电泳的电极缓冲液或层析的洗脱液。Running buffer在蛋白反应中的主要作用是为反应提供适当的离子环境，包括pH、渗透压、离子强度等1。SDS以及巯基乙醇可以让蛋白质的高级结构完全瓦解，变成直线棒状的蛋白质会在电场的作用下，在PAGE的网孔中穿梭向前跑，那些个头越小跑得速度越快，个头越大受到的阻力越大，跑得越慢，那么组织或者细胞的蛋白质就会在PAGE的跑道上依次排开，蛋白质就可以通过已知的分子量个头大小进行分析。

8.定量逆转录PCR（quantitative reverse transcription PCR, RT-qPCR）是应用于以RNA作为起始材料的PCR实验中的一种实验方法。在该方法中，总RNA或信使RNA（mRNA）首先通过逆转录酶转录成互补DNA（cDNA）。随后，以cDNA为模板进行qPCR反应。RT-qPCR已被用于多种分子生物学的应用中，其中包括基因表达分析、RNA干扰验证、微阵列验证、病原体检测、基因测试和疾病研究。

9. 染料法 SYBR Green qPCR的体系中添加了一种DNA双链小沟结合染料, 即SYBR Green。 它与DNA结合时发光，游离时不发光，所以每形成一条DNA双链，就会有一定数量的染料结合上去，就会产生荧光信号，信号强度与DNA分子总数目成正比。

10.qPCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值时的所对应的扩增循环数（Cycle Threshold）。C代表Cycle，T代表Threshold。简单讲，Ct值就是qPCR中起始模板扩增达到一定产物量时，所对应的循环数。所谓“一定产物量”后续作进一步解释。

11. DNA熔解温度，指把DNA的双螺旋结构降解一半时的温度，亦即DNA 变性过程中，紫外吸收值达到最大值的50%时的温度称为 DNA 的解链温度(Tm)。

12.模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系。起始模板量浓度越高，Ct值越小；起始模板量浓度越低，Ct值越大。

13. SYBR Green I 是高灵敏的 DNA 荧光染料，适用于各种电泳分析，操作简单，无须脱色或冲洗；至少可检出 20pg DNA，高于 EB 染色法 25-100 倍。SYBR Green I 与 dsDNA 结合荧光信号会增强 800-1000 倍，用 SYBR Green I 染色的凝胶样品荧光信号强，背景信号低，可适用于多种电泳分析。

14.免疫外科法是指什么

在人类胚泡的ICM中发现了ES细胞，这是在受精后第4天到第7天，胚胎生长的早期阶段。胚泡是指在着床前胚胎发育的阶段，它包含两种细胞。 滋养外胚层处于外层，提供额外的胚胎膜。 内细胞团(ICM)形成胚胎本身。

在正常的胚胎发育过程中，ES细胞在第7天之后消失，并开始形成三个胚胎组织层。然而，从胚泡阶段的ICM中提取的ES细胞在实验室中能够被体外培养，并在合适的条件下可以无限繁殖。在这种未分化状态下的ES细胞保持了分化成所有三个胚胎组织层细胞的能力。最后，内细胞团的细胞产生了所有的胚胎组织。在胚胎形成阶段中，即接近胚泡生长的第一周周末时，可从胚泡的ICM获得ES细胞。

补体是一种血清蛋白质，存在于人和脊椎动物血清及组织液中，不耐热，活化后具有酶活性、可介导免疫应答和炎症反应。

免疫外科法这是一种分离内细胞团(ICM)的常规方法。采用补体介导的细胞溶解方法分离内细胞团(ICM)。在该方法中，使胚泡曝露于酸性tyrode溶液或链霉蛋白酶溶液中，以除去胚泡的透明带(壳)。然后将无带的胚胎曝露于人类表面抗体中达30分钟到1小时。然后将胚胎曝露于豚鼠的补体中以溶解滋养外胚层。采用精细牵引(drawn)的巴斯德吸液管重复性机械式的移液方法，从内细胞团(ICM)中除去补体介导的已被溶解的滋养外胚层细胞。近期文献中报道的所有胚胎干细胞系都是通过该方法获得的。然而，该方法具有几个缺点。首先，胚胎长时间地曝露于酸性的tyrode溶液或链霉蛋白酶溶液中，导致了对胚胎的有害作用，并因此使胚胎本身的发育能力降低。其次，该方法需要花费1.5到2.0小时的时间，因此是一种很费时的方法(Narula等，1996)。第三，每一胚泡的内细胞团(ICM)的收率很低。第四，该方法中采用的抗体和补体要求苛刻的储存条件。（利用兔抗补体血清与TE结合，用豚鼠二抗与一抗结合，杀死TE）

15. 实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR, qPCR）

实时荧光定量PCR，也叫Real-Time PCR，即二代PCR，是指在PCR扩增反应体系中加入荧光染料或者荧光基团，在整个PCR过程中通过收集荧光信号实时监测每一个循环中扩增产物量的变化，最后通过标准曲线和CT值对待测样品进行定量分析。qPCR常用的有两种方法：SYBR Green法和TaqMan探针法。

16.实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR, qPCR）

实时荧光定量PCR，也叫Real-Time PCR，即二代PCR，是指在PCR扩增反应体系中加入荧光染料或者荧光基团，在整个PCR过程中通过收集荧光信号实时监测每一个循环中扩增产物量的变化，最后通过标准曲线和CT值对待测样品进行定量分析。qPCR常用的有两种方法：SYBR Green法和TaqMan探针法。

①荧光染料法（SYBR Green）：SYBR Green Ⅰ是荧光定量PCR中最常用的荧光染料，它能与所有的双链DNA结合。在PCR反应体系中，加入SYBR Green Ⅰ，它就会在过程中与双链DNA结合，从而产生荧光信号。因此，反应中发出的全部荧光信号就会与反应中双链DNA的量呈正比，荧光强度也会随着产物的增加而增加。但是由于染料与双链DNA是非特异性结合，因此可能产生假阳性的结果。

优点：价格相对较低；使用方便；对DNA模板没有选择，通用性好；检测灵敏度高。

缺点：可能产生假阳性结果，需要通过熔解曲线分析识别扩增产物的特异性；需要不断优化反应体系以降低非特异性扩增；不适合进行多重qPCR检测。

②荧光探针法（TaqMan技术）：TaqMan探针是最早用于定量的方法，也是临床检测中最常用的检测方法。PCR扩增时，加入一对引物的同时再加入一个特异性的荧光探针。该探针是一个寡核苷酸，5'端标记一个荧光报告基团（Reporter, R），3'端标记一个淬灭基团（Quencher, Q）。当探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，以至于无法检测到荧光信号；而当PCR扩增时（在延伸阶段），探针会被Taq酶的5'→3'外切酶活性酶切降解，使报告基团和淬灭基团分离，报告基团发射底的荧光不会再被吸收，从而可以在荧光监测系统接收到荧光信号，即每扩增一条DNA，就形成一个荧光分子，PCR产物的形成与荧光分子的形成完全同步，PCR产物越多，荧光信号累积的越多，荧光强度越大。

优点：检测特异性强；灵敏度高；适合进行多重qPCR检测；PCR后续无需处理，节省时间和原料成本。

缺点：需要根据不同的序列，合成不同的探针；探针的水解依赖Taq酶外切酶的活性，定量时容易受试剂和酶性能影响；淬灭难以彻底，本底较高；检测结果很难判断实际的扩增特性。

17.RT-qPCR

real-time RT-PCR (RT-qPCR)就是结合了荧光定量技术的反转录PCR: 先从RNA反转录得到cDNA (RT),然后再用Real-time PCR进行定量分析（qPCR)。

18. 根据葡萄糖含量的高低，DMEM培养基一般可以区分为高糖型 (低于4500mg/L)和低糖型 (低于1000mg/L)两种。 其中，高糖型DMEM培养基有利于细胞停泊于一个位置生长，适于生长较快、附着较困难的肿瘤细胞等。

19. MEM培养基（Minimum Essential Medium）是动物细胞培养中的常用的培养基，主要是贴壁细胞的培养，修改配方后也可用于其他类型细胞培养，例如如无钙（Ca）MEM培养基可被用于悬浮细胞的培养，而Hank’s平衡盐的MEM培养基可被用于二倍体细胞的培养。

20. DMEM是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基，是在MEM培养基的基础上研制的。与MEM比较增加了各种成分用量，同时又分为高糖型（高于4500mg/L）和低糖型（低于1000mg/L）。高糖型有利于细胞停泊于一个位置生长，适于生长较快、附着较困难肿瘤细胞等。

显微注射注意方面：

1.看注射的形变量决定了注入的体积是多大。

2.左手固定胚胎，右手注射针注射—边调边踩—menu—换针change capillary

3.合子时期的胚胎长什么样

4.各个时期胚胎的发育形态

5.根据雌原核和雄原核的大小和距离，可以分为5个时期：PN2-PN3

6.注射的时候不能打到核，只能打到细胞质，否则会伤害细胞。

7.细胞的韧性很强，针扎进去就是明亮的，扎不进去，太黑的是机械损伤，死了。

8.把针放进去，粗调改细调。

9.把参数调整为pi:1324 ti(s):0.17s pc(hpa):38

10.有原核的胚胎长什么样

11.把胚胎吹到培养基里培养。养一些无受精的细胞作为有抑制剂（使2细胞阻滞）的对照。若实验组的细胞停留在2细胞期，则认为抑制剂没有问题。

12.注射完，记得拔管子--menu—长按关机键—关机器屁股后面的按钮-取针。

13.物镜调到4×，左下光最低，光旁边开关关，右后关。针放利器盒。

细胞间：

质粒 DNA 和其他包装质粒共转染细胞（293T 细胞）产生病毒，即为病毒包装。

293T 细胞是由 293 细胞派生, 表达 SV40 大 T 抗原的人肾上皮细胞系, 被广泛应用于瞬时转染以过表达各种目标蛋白, 或是用以包装病毒。

病毒包装的原理（以慢病毒包装为例）

慢病毒（Lentivirus, LV）是由人类免疫缺陷病毒（HIV）改造而来的一种病毒载体，属于逆转录病毒。慢病毒可将特定基因片段随机、稳定地整合到宿主细胞的基因组中，实现目的基因的持续稳定的表达目的产物， 因此，目前慢病毒载体已经广泛地应用于基因的表达调控如过表达，干扰和基因敲除。

腺相关病毒（Adeno-associated virus, AAV）由直径约 26nm 的二十面体蛋白质衣壳和约 4.7 kb 的单链 DNA 基因组组成。主要以游离于染色体的附加体形式存在，并可长期存在于非分裂期的细胞中。由于具有高组 织特异性、低免疫原性、良好的扩散性、高安全性以及宿主范围广等特点，AAV 特别适用于体内的研究， 且已成为基因治疗领域中最具前景的病毒载体之一。

腺病毒是一种无包膜的双链DNA病毒，在自然界中广泛分布。完整的病毒颗粒为二十面体对称结构，直径70-100nm，衣壳含有240个六邻体（hexon）、12个五邻体（penton）、12根纤毛（fiber）及一些小蛋白等。哺乳动物腺病毒的基因组DNA长约36kb，基因组的两端各有约100bp的反向末端重复序列（ITR），ITR与末端蛋白（TP）相结合，与基因组复制及早期基因的转录有关，ITR的内侧为病毒包装信号Ψ，参与腺病毒基因组的衣壳化。基于人血清5型腺病毒的基因组结构，结合各基因的功能，科学家们开发了缺失E1和E3基因的Ad5腺病毒载体。E1基因在组装感染性病毒颗粒时必不可少，但是可以在HEK293包装细胞中得到补充，而E3基因不影病毒的包装。由于E1和E3基因的缺失，腺病毒载体可插入高达7.5kb的外源基因。

病毒包装的原理（以慢病毒包装为例）质粒 DNA 为能转录出慢病毒遗传物质（RNA），但不能翻译出慢病毒的外壳及蛋白成分的载体质粒，其同时连有目的基因和报告基因，psPAX2 为能表达慢病毒外壳的质粒，其表达产物可通过粘附机制更易穿过细胞膜， pMD2.G 为慢病毒的膜蛋白质粒，通过lipofectamine2000 进行三质粒共转到靶细胞基因组中，宿主基因组在表达时，随宿主基因转录出的目的基因 RNA 与 psPAX2、pMD2.G 基因翻译出的蛋白组装为慢病毒。病毒进入细胞后，其遗传物质 RNA 反转录出 DNA，该基因再整合到靶细胞的基因组中，完成转染过程，因为质粒 DNA 只能转录出病毒 RNA 和表达目的基因却不能表达出病毒的外壳和膜蛋白成分，因此其不能像普通的病毒一样在宿主细胞能反复增殖，故对宿主细胞是无害的并且高效的将目的基因转然到靶细胞基因组中。