高选择性整合素αvβ6和αvβ8小蛋白抑制剂的从头设计

作者 | 金小程 审稿 | 刘 南

今天为大家介绍的是一篇由美国华盛顿大学生物化学系和蛋白质设计研究所及杨百翰大学化学与生物化学系的研究人员共同完成的一篇论文，发表在bioRxiv上。这篇文章描述了一种计算设计超稳定的含RGD（一种合成肽，对应于整合素的细胞粘附序列，一些癌症、纤维化的靶标）的小蛋白的方法，设计的小蛋白对单个RGD整合素（αvβ6和αvβ8）异二聚体和构象状态具有具有皮摩尔亲和力，相对于其他RGD整联蛋白具有>1000倍的选择性。在博来霉素诱导的肺纤维化小鼠模型中，通过模拟吸入的口咽给药递送时，αvβ6抑制剂有效地降低了纤维化负荷并改善了总体肺力学，证明了从头设计的整合素结合蛋白具有高选择性的治疗潜力。

能够与RGD（Arg-Gly-Asp）结合的整合素αvβ6和αvβ8是相当重要的临床验证的癌症和纤维化靶标。高度同源的整合素αvβ6和αvβ8与潜在转化生长因子β1和β3（L-TGF-β1和LTGF-β3）结合，导致活性TGF-β1和β3的释放。TGF-β活化的上调是多种疾病的驱动因素，包括特发性肺纤维化、原发性硬化性胆管炎和几种实体瘤。靶向整合素的选择性抗体已经通过免疫小鼠产生，但是这种方法缺乏对整合素上的靶结合位点的精确控制。由于八种整合素异二聚体（包括ανβ6和ανβ8）共享保守的RGD结合序列，不可能产生针对单个整合素的选择性RGD模拟小分子。因此，需要一种新的整合素治疗方式，其具有治疗肿瘤的作用以及对单个RGD整合素异二聚体的高选择性、高亲和力、超稳定性以实现组织限制施用（吸入和口服）、比IgG抗体更小的流体动力学尺寸以实现更好的组织渗透。

计算设计策略

研究者开发了一种生成超稳定的从头设计整合素结合蛋白（<75个氨基酸）的计算方法，从头整合素结合蛋白具有高整合素选择性和对于治疗疾病最佳的特异性受体结合界面。作者首先分析了整合素αvβ6和αvβ8与L-TGF-β1和β3的结合中一些关键的接触界面，如：在与整合素结合的含RGD的肽的其他结构中，精氨酸和天冬氨酸侧链与整合素α和β亚基之间的界面处的残基形成多个氢键和盐桥相互作用。对于αvβ6和αvβ8，RGD的C-末端，肽采用α-螺旋样转角，其中两个亮氨酸有利于β 6/β 8亚基特异性决定环2形成疏水口袋（SDL2）。作者专注于与L-TGF-β3肽中的LXX（L/I）基序接触的区域和β亚基上的电荷反转。并且假设生成的minibinders分别与αvβ6和αvβ8的Y185/L174（与L-TGFβ3肽的Leu接触）和E316/K304（发生电荷反转）区域相互作用，可能能够实现两种蛋白之间的选择性。为了实施该设计策略，作者尝试生成包含中央RGD亲和环的小蛋白，与α和β亚基两者进行有利的接触，并与上述两个结构上不同的区域密切相互作用。

设计流程

从与含RGD的L-TGF-β3肽复合的人αvβ6的晶体结构开始，在计算机上筛选PDB数据库中能够容纳肽的8个残基延伸转角构象的拓扑结构和结构片段（RGDLGALA）。发现了小的α/β铁氧还蛋白折叠能够支撑RGDLXX（L/I）结合环而不与整合素冲突，同时与α和β亚基额外接触。按照构建理想蛋白质的规则从片段组装结构，采样不同的α螺旋、β折叠和环长度，同时将对应于RGD肽的区域中的扭转角限制为使用Rosetta在共晶结构中观察到的那些。

经过两轮设计优化后，选择两种高亲和力变体(B6B8_BP\ B6_BP)用于进一步表征。进一步，为了实现对β8亚基的选择性，作者利用β亚基上的K304电荷反转新设计了β-loop。使用RosettaRemodel生成了200个具有不同长度和构象的β-loop的模型，并且通过叠加在RGD肽上将所得模型叠加在L-TGF-β 1/αvβ8复合物结构上。使用Rosetta重新设计β-环和LXX（L/I）基序，并且在使用AlphaFold进行结构预测之后选择了具有最低预测结合能的总共9个设计。其中4个显示优先结合αvβ8整合素，其中B8_BP_dslf显示出对αvβ8的最高亲和力和选择性。与人αvβ8结合亲和力为1.9 nM，与人αvβ6的结合不明显(1 µ M)。

实验表征

B6B8_BP和B6_BP对其靶标具有皮摩尔亲和力，并且相对于其他RGD整联蛋白具有>1000倍的选择性。同时B6_BP比B6B8_BP对αvβ6更具选择性，在K562细胞表面上，B6_BP以比ανβ8更高的亲和力结合ανβ6，Kd分别为0.11（± 0.09）和580（± 40）nM。通过BLI证实，经过热稳定性改造后的变体B8_BP_dslf，B6_BP_dslf选择性与相应靶点结合，不结合任何其他结合RGD的整合素。在口服IPF治疗的临床试验中，证实B6_BP_dslf和B8_BP_dslf对其各自的整联蛋白靶标具有精确的选择性和亲和力，具有比小分子PLN-74809和GSK 3008348显著更大的RGD整联蛋白选择性。

作者使用单粒子低温电子显微镜（cryoEM）来确定与B6_BP_dslf结合的人αvβ6胞外域和与B8_BP_dslf结合的人αvβ8胞外域的稳定复合物的结构。所设计的B6_BP_dslf微结合物模型的二级结构元件与cryoEM图紧密一致（复合物RMSD ：0.6），并且三个微结合物环与整合素的α、β或两个亚基接触，只有一些相互作用与初始设计略有不同。ανβ8 - B8_BP_dslf复合物的cryoEM模型也非常接近计算设计模型（复合物RMSD ：0.7）。使用博来霉素诱导的肺纤维化（PF）小鼠模型研究了B6_BP_dslf的治疗功效。在该模型中，当通过模拟吸入的口咽给药递送时，αvβ6抑制剂有效地降低了纤维化负荷并改善了总体肺力学，证明了从头设计的整合素结合蛋白具有高选择性的治疗潜力。

讨论

本文设计的αvβ6抑制剂（B6_BP_dslf）与其靶标结合的亲和力和选择性高于任何先前报道的线性或环状肽或二硫键交联的αvβ 6结蛋白抑制剂，并且与领先的抗体BG 00011相当，但是由于该抗体自身限制，已不应用于吸入给药的方式，而雾化后B6_BP_dslf的性质不变，因为该蛋白是单体的，热稳定的，并以相似的亲和力与αvβ6结合。

本研究中基于结构的从头设计策略具有很高的准确性，通过整合先前已知的结合基序并在超稳定的小支架中引入全新的相互作用来实现高选择性。该方法应广泛适用于开发对许多治疗上重要的细胞表面受体家族的单个成员具有高选择性和亲和力的结合剂。

参考资料

Roy, Anindya, Lei Shi, Ashley Chang, Xianchi Dong, Andres Fernandez, John C. Kraft, Jing Li et al. "De novo design of highly selective miniprotein inhibitors of integrins αvβ6 and αvβ8." bioRxiv (2023): 2023-06.