单细胞转录组揭示了人类新生儿和成人椎间盘的细胞异质性

前言

题目：Single-cell atlas unveils cellular heterogeneity and novel markers in human neonatal and adult intervertebral discs 日期：2022-07 期刊：iScience 链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2589004222007751

摘要

目前至少有 30% 的成年人患有腰痛，其起源于椎间盘 (IVD) 退化，但是其中细胞的起源、组成、分布和功能尚未完全了解。本文构建了人类新生儿和成人 IVD 的细胞图谱，揭示了在新生儿和成人 IVD 中存在两个脊索细胞 (NC) 亚群及其相关基因标记。发育轨迹预测了 7 种不同的细胞状态，描述了 IVD 中从新生儿到成年细胞的发育过程，并分析了 NC 在 IVD 发育中的作用。

新生儿和成人 IVD 细胞由 15 群组成

首先将样本整合，然后聚类分群，得到15个群

分别映射到新生儿和成人：

之后根据marker基因进行细胞类型注释：

• notochordal cells (NCs) markers：MAP1B， SOX4, SOX17 , ITGA6 and BASP1
• NC-like NP cells (NPCs) markers：ACAN , COL2A1 and SOX9
• annulus fibrosus cells (AFCs) markers：COL1A1 , CALR and HSPA6
• non-mesenchymal cells：MEG3
• monocytes：CD44，CD14
• red blood cells：HBB，HBA1

脊索细胞（notochordal cells，NC）继续分群

根据NC的marker（MAP1B和SOX4）将新生儿IVD的cluster1和2定义为NC细胞群，它又可以分群2群：NC1、NC2，其中NC1 表达SOX17和ITGA6，而 NC2 表达CD44。在成人中也可以分成2个亚群，NC2 的占比会 NC1 高得多。

差异分析显示，FABP4是新生儿和成人 IVD 中 NC1共有的显著marker基因；AKR1C1是新生儿 IVD 的 NC2 marker基因；APOE的表达相对较低，不过它在整个NC群中都有表达。有趣的是，AKR1C1 是成人 IVD 中NC1和NC2 中唯一共有的marker基因。

之后比较了FABP4、AKR1C1和APOE在新生儿和成人 IVD 中的表达水平，因为作者认为它们的表达量和年龄段有关系。分析发现FABP4仅在新生儿 NC1有明显表达；AKR1C1在成人 IVD 中失去了一些特异性，但对NC1和 NC2仍然可以区分。

进一步研究这些marker基因在调控网络中的作用，发现FABP4在新生儿 IVD 的 VEGF 调节网络中起着关键作用，其中 VEGF 的上调会激活NC的markerFABP4、 ITGA6，以及激活炎症因子CXCL8 ，并下调ACAN表达。在成人 IVD 中，FABP4 被P38 MAPK调节因子激活。

在新生儿的NC2亚群中，AKR1C1和AKR1C2在TGFB1级联反应中起到关键作用，还会导致经典 NC 的marker基因MAP1B和免疫相关CD44的激活。AKR1C1的激活与多种生物学功能相关，比如AKR1C1/AKR1C2的上调可激活多种肿瘤和癌症相关通路。

NPC继续细分并且和NC比较

NPC继续分群得到：NPC1（marker基因OGN），NPC2 （MMP13）, NPC3 （COL9A1），NPC4 （DPT）

然后作者比较了新生儿和成人 IVD 中的NC和NPC细胞群，发现NC 群优先富集在癌症和肿瘤活动、细胞代谢、细胞稳态、血管生成以及细胞粘附和扩散，而 NPC 群优先富集细胞骨架组织形成、细胞质发育、创伤愈合和 ECM 发育。

新生儿和成人 IVD 的单细胞图谱

作者将cluster12分给了非间充质细胞（non-MC），marker基因是MEG3

cluster 13是immune-like cells (IC)，表达免疫细胞marker CD14和CD44

Cluster 14 and 15是RBC2 and RBC1，表达血红蛋白marker的HBB和HBA1

总的来说，人类的IVD主要分成了：NC, NPC, AFC, IC, non-MC, and RBC，然后细分为NC1-2, NC/NPC, NPC1-4, iAFC, oAFC1-3, non-MC, IC, and RBC1-2

IVD 中涉及的关键通路之一是 Wnt/β-catenin 通路，作者发现 Wnt/β-蛋白通路在新生儿 NC 中被激活，但在新生儿和成人 NPC 中下调。然后进一步挖掘了 Wnt/β-catenin 通路中的关键基因，发现与新生儿与成人的 NPC 相比，新生儿 NC中SOX4调节因子（也是 NC 的marker基因）的表达上调。相比于新生儿的NPC，另一种调节基因SOX9在新生儿NC中下调。

新生儿到成年的细胞发育变化

轨迹推断发现新生儿和成人各自独享2个分支，然后相互共享一个分支。ECM 的marker基因也随着拟时序变化，其中COL1A1表达随着时间减少，而COL2A1在早期减少但在后期增加，ACAN则出现增加-减少-增加的趋势。SOX4是 Wnt/β-catenin经典通路的正调节因子，表达量随着拟时序降低，但负调节因子（SOX9）会增加。

沿着轨迹发现了 7 个细胞状态。状态 1是新生儿细胞，因为它的细胞组成起源于新生儿 IVD。状态 2 被注释为新生儿 NPC，因为它仍处于新生儿阶段，但主要由 NPC 组成。状态 3 被注释为 NPC 的 NC，因为它包含新生儿和成人细胞，并且由 NC 和 NPC 组成。状态 4 和状态 5 是包含 NPC、NC 和 AFC 的两个中间阶段。状态 6 被注释为成人 AFC，因为它由成人细胞占据主导，主要是 iAFC 和 oAFC。状态 7 被注释为成年 NPC，因为它以成年 NPC 为主，有少量 NC 和 AFC。

总的来说，状态 1 可能表示早期发育阶段，而状态 2 和 3 可能表示 NC 发展成 NPC 的过程，这可能发生在新生儿阶段。状态 6 可能表明 AFC 在发育过程中存在于两个年龄段，但它们可能从新生儿 AFC 发展为成人 AFC。状态 7 可能表明成人中大量 NPC 的发展可能源自新生儿 NC，表明成人 IVD 中还依然存在 NC。

小结

作者首次比较了新生儿和成人 IVD 单细胞水平的细胞图谱，发现FABP4、AKR1C1和APOE可以作为人类 NC 的新标记基因。之后拟时序分析揭示了由各种细胞类型组成的新生儿 IVD 到主要由 NPC 和 AFC 组成的成人 IVD 的发育过程。