单细胞转录组揭示系统性红斑狼疮的特定细胞类型的基因表达变化

前言

题目：Single-cell RNA-seq reveals cell type–specific molecular and genetic associations to lupus 日期：2022-04-08 期刊：Science 链接：https://www.science.org/doi/abs/10.1126/science.abf1970

摘要

系统性红斑狼疮（SLE）是一种影响多器官系统的异质性自身免疫性疾病，在亚洲、非洲和西班牙裔女性和个体中患病率较高。大量的常规转录组研究发现：I型干扰素信号通路增加、淋巴细胞激活失调和凋亡清除失败是SLE疾病的标志。目前对SLE患者的循环免疫细胞整体情况的了解仍然不完整，并且对介导遗传关联的细胞类型和细胞环境进行注释仍然具有挑战性。

PBMCs的单细胞RNA测序（scRNA-seq）作为一种全面、无偏、同时分析循环免疫细胞组成和细胞类型特异性转录状态的方法，但其在人群队列中的应用一直受到了低样本通量、高成本等限制。为了克服这些限制，加州大学旧金山分校的研究团队开发了“多线程单细胞测序（multiplexed scRNA-seq）”，简称mux-seq，能够系统且经济的对人群队列进行单细胞测序。

文章对162名系统性红斑狼疮患者和99名亚裔或欧裔健康对照者的共120多万份外周血单个核细胞（PBMCs）进行单细胞测序分析，研究SLE相关过程特定细胞类型的基因表达变化。

研究方法

作者使用的样本来自加州狼疮流行病学研究院（CLUES）和ImmVar联盟，对其中264个独立样本的120万个外周血单个核细胞（PBMCs）进行了测序。

264个独立样本及91个重复样本混合成23个样本，分4批检测。第3批（155034个细胞）和4批（375261个细胞）分别使用了16、99个表面抗体进行细胞表面蛋白表达量分析。

质控得到1444450个细胞。再使用Scrublet去除doublet、污染血小板和红细胞，最终数据集中总共剩下1263676个细胞。

SLE患者中CD4+T细胞淋巴细胞减少

聚类分群得到23个clusters，然后注释得到11种细胞类型：

CD14+ classical and CD16+ nonclassical monocytes (cM and ncM); conventional and plasmacytoid dendritic cells (cDC and pDC); CD4+ and CD8+ T cells (CD4 and CD8); natural killer cells (NK); B cells (B); plasmablasts (PB); proliferating T and NK cells (Prolif); and progenitor cells (Progen)

• 相对于对照组，SLE组最显著的变化是CD4的下降，以及cM、Prolif细胞增加；亚洲病例的CD4百分比下降更大。
• 将另外100个病例与154例对照进行比较，发现淋巴细胞丰度显著降低，但单核细胞丰度无差异
• 为了评估淋巴细胞减少和SLE之间是否存在因果关系，作者将遗传数据与免疫细胞组成使用 GSMR 包进行分析。发现与淋巴细胞丰度相关的变异与SLE风险负相关。不过没有显示SLE风险对淋巴细胞减少的介导作用

SLE中 naive CD4+T细胞的减少和细胞毒性 CD8 + T 细胞的增加

之前的研究显示，在SLE患者的淋巴细胞中，T和B记忆细胞的激活受损，而ISGs（interferon–stimulated genes）的表达升高。作者为了探索SLE中淋巴细胞群的表达谱的变化，对淋巴细胞重新聚集，并将得到的26个细胞簇注释到14个亚群，7个T细胞亚群、2个NK细胞亚群、4个B细胞亚群及1个Progen细胞亚群。发现NK和B细胞亚群的SLE和对照组中没有显著差异。

关于CD4+T细胞

CD4+ T的3个细胞亚群为：CD4Naive【表达CCR7的naive幼稚细胞】、CD4EM 【缺乏CCR7表达、表达OX40受体（TNFRSF4）和IL7R的效应记忆细胞】、CD4Reg【表达转录因子FOXP3及其直接靶点RTKN2的调节细胞】。与对照组相比，SLE中最显著的变化是CD4Naive的降低。CD4Naive的占比与年龄或治疗没有显著相关性。

关于CD8+T细胞

CD8+ T的4个细胞亚群为：CD8Naive【表达CCR7的naive细胞亚群】、CD8MAIT【表达KLRB1 、GZMK】和两个缺乏KLRB1、表达CCL5、PRF1和LAG3的效应记忆亚群CD8GZMH、CD8GZMK。

• CD8GZMH、CD8GZMK可以通过颗粒酶（GZMH、GZMB和GZMK）的表达来区分。与对照组相比，病例中CD8GZMH百分比显著增加，而CD8MAIT百分比降低。
• 所有细胞中，细胞毒性和ISG特征基因以及细胞毒性和衰竭特征基因的相关性普遍较低。为了进一步调查CD8GZMH和CD8GZMK的克隆性，作者对T细胞受体（TCR）的CDR3区域进行扩增测序，从10.2%的CD4和8.7%的CD8获得配对的TCRA和TCRB序列。在扩增的CD8克隆中，59%来自CD8GZMH细胞，21%来自CD8GZMK细胞。相对于对照组，病例在CD8细胞中表现出受限制的细胞库。在CD8GZMH亚群中，表达细胞毒性特征的细胞与表达ISG特征的细胞扩增后的比例大概为4：1。

I 型干扰素刺激 SLE 中骨髓细胞的基因表达

在病例和对照组中，髓系细胞表现出最多的DEG，为了进一步研究其异质性，作者将髓系细胞重新聚集为6个亚群：

• 单核细胞系（cM：CD14+；ncM：FCGR3A+；ncMcomp：C1QA+ /FCGR3A+）
• 树突状细胞系（cDC1：CLEC10A+；cDC2：CLCEC9A+；pDC：IRF7+）

与对照组的骨髓细胞相比，病例组的pDCs、cDC1s 和 cDC2s百分比降低，cMs 和 ncMcomps 百分比增加。

使用RNA velocity来评估每种髓系细胞类型的转录异质性，在cMs、ncMs和ncMcomps 中，SLE患者细胞在高度活化区域富集，cDC细胞群体结果也是类似。

具有较高SLEDAI指数（SLE Disease Activity Index）的患者有着更高的细胞激活程度。与亚洲病例相比，欧洲病例的推测细胞平均激活程度与SLEDAI的相关性更好。

SLE 疾病状态的临床预测和分子分型

SLE的诊断困难之一是疾病表现的广泛异质性，伴随而来的是个体临床特征与基因模块评分的相关性较弱。因此作者将各模块基因的表达作为SLE的临床预测和分子分型的特征。虽然302个表达特征对区分SLE-对照组状态具有良好的预测能力（AUC= 0.84），但它们对个体临床特征的预测能力很有限，反映了临床特征和模块评分之间较弱的相关性。

为了对病例进行分子分型，作者进行了表达特征的主成分分析，然后进行K-means聚类成2个群体，发现PC1与Panup、Myeup和Bup模块中的基因相关最多，其中包括IFITM3的髓系特异性表达。使用mux-seq获得的细胞类型特异性表达谱可用于将细胞内在状态的变化联系起来，可用于预测病例和对照状态，并对SLE患者进行分子分型。

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干扰素修饰细胞类型的特异性遗传效应对基因表达的影响

作者想要探索在SLE患者中观察到的可变I型干扰素激活是否可以改变体内对基因表达的遗传影响。

在SLE病例中鉴定到了35个cis-eQTL与Panup ISG信号相互作用的基因，称之为IFN-eQTL。之前在树突状细胞中发现的干扰素反应cis-eQTLs （reQTLs）在cMs中显著，但在其他类型的细胞中不显著。作者在骨髓和B细胞中复制了rs11080327（A>G）作为SLFN5的IFN-eQTL，但在NK或T细胞中不能复制。发现rs11080327在淋巴母细胞系中为cis-eQTL，在rIFNB1调控的树突状细胞中为cis-reQTL。

然后，作者对5个PBMCs进行了mux-seq的单细胞ATAC-seq，在大多数细胞类型中， rs11080327附近的基因组区域的可及性较低，并且在刺激后可及的基因型依赖性增加。

以上结果表明与rs11080327重叠的区域含有顺式调节元件，该元件在I型干扰素作用下被激活。因此说明，遗传差异不仅可能使个体易患系统性红斑狼疮，而且还可能影响个体对疾病状态的反应。

小结

本文利用mux-seq对系统性红斑狼疮患者120多万PBMCs进行了分析。发现细胞组成水平上，SLE患者幼稚CD4+ T细胞减少（特别是亚洲谱系），可以解释SLE患者临床上观察到的淋巴细胞减少的现象。在转录水平上，cMs和ncMs产生最多的I型ISG特征，包括髓系细胞特异性的基因。通过对cis-eQTLs和全基因组关联研究结果的联合分析，可以识别与免疫疾病治疗相关的细胞类型，对疾病相关位点进行精准定位，使发现新的SLE相关性位点成为可能。