单细胞转录组学揭示未经治疗的骨肉瘤肿瘤微环境的复杂性

文章概述

文章标题：《Single-Cell Transcriptomics Reveals the Complexity of the Tumor Microenvironment of Treatment-Naive Osteosarcoma》

发表日期和杂志：2021年发表在Frontiers in Oncology上

在线阅读链接：https://doi.org/10.3389/fonc.2021.709210

文章通过单细胞转录学揭示了未经治疗的骨肉瘤肿瘤微环境的复杂性，之前我们分享过晚期骨肉瘤中肿瘤内异质性和免疫抑制微环境的单细胞RNA景观，那一起来看一下治疗初始数据有哪些不一样吧！

实验设计

在本研究中，从六名OS患者中分离出组织，然后使用10× Genomics平台进行单细胞RNA测序（scRNA-seq）。随后使用多重免疫荧光染色来验证由scRNA-seq确定的亚群。在六名OS患者接受新辅助化疗前进行了scRNA-seq，并获得了29,278个细胞的数据。

骨肉瘤（Osteosarcoma，OS）简介

骨肉瘤（Osteosarcoma，OS）是一种最常见于青少年和儿童的恶性骨肿瘤。它通常发生在骨骼的快速生长区域，如膝部附近的股骨或胫骨，以及上臂骨。也可以发生在任何骨骼中。

骨肉瘤的症状可能包括疼痛（尤其是在夜间或进行活动时）、肿块或肿胀、骨折（在没有明显创伤的情况下）、疲劳、体重减轻等。然而，这些症状可能与其他较为常见的疾病相似，因此骨肉瘤在早期可能难以诊断。

骨肉瘤的诊断通常包括影像学检查（如X光、CT扫描、MRI等）、活组织检查（病理学检查）和可能的血液检查。治疗方法可能包括手术（以移除肿瘤）、化疗（以杀死癌细胞或阻止其生长）、放疗（尤其是在手术无法进行或者癌症已经扩散的情况下）。

单细胞转录组数据情况

数据链接是：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE162454

文章给的单细胞RNA测序数据一共是6个样品。

GSM4952363 Patient 1 tissue of an osteosarcoma
GSM4952364 Patient 2 tissue of an osteosarcoma
GSM4952365 Patient 3 tissue of an osteosarcoma
GSM5155198 Patient 4 tissue of an osteosarcoma
GSM5155199 Patient 5 tissue of an osteosarcoma
GSM5155200 Patient 6 tissue of an osteosarcoma

提供了10X 标准格式的下载文件，直接下载之后使用Read10X函数读取即可。

数据下载导入，并创建Seurat对象：

###### step1:导入数据 ######  
samples=list.files('GSE162454_RAW/outputs' )
samples 
sceList = lapply(samples,function(pro){ 
  # pro=samples[1] 
  print(pro) 
  sce=CreateSeuratObject(Read10X(file.path('GSE162454_RAW/outputs/',pro)) ,
                         min.cells = 5,
                         min.features = 300,
                         project =   pro )
  
  return(sce)
})
names(sceList)  
samples 

sce.all <- merge(sceList[[1]], 
                 y= sceList[ -1 ]  ) 

as.data.frame(sce.all@assays$RNA@counts[1:10, 1:2])
head(sce.all@meta.data, 10)
table(sce.all@meta.data$orig.ident) 

后面就是标准分析啦,对读取进来的数据进行质控、harmony整合以及细分亚群定义等。

第一层次降维聚类分群

文章中对对所有细胞的差异表达基因进行了UMAP分析，该分析鉴定出9个主要的细胞簇。

其中免疫细胞主要有：

• myeloid cells(1 and 2)
• NK/T cells
• B cells
• plasmocytes

非免疫细胞主要是：

• osteoblastic OS cells
• endothelial cells
• OCs
• CAFs

免疫细胞在前面的推文中已经分别介绍了不同的免疫细胞的功能，那这次主要学习一下不同的非免疫细胞：

• 成骨性骨肉瘤细胞（Osteoblastic OS cells）：这是一种特殊类型的骨肉瘤细胞，它们具有成骨细胞的特性，能够产生骨质。这些细胞在骨肉瘤中起着关键的作用，因为它们可以通过分泌特定的蛋白质来促进肿瘤的生长和扩散。
• 内皮细胞（Endothelial cells）：这些细胞构成了血管的内层，负责调节血液的流动和物质的交换。在肿瘤微环境中，内皮细胞可以通过生成新的血管来供应肿瘤的生长，这个过程被称为血管生成。
• OCs：这是Osteoclasts（破骨细胞）的缩写，它们是一种大型的多核细胞，主要负责骨骼的重塑和骨质的吸收。在骨肉瘤中，破骨细胞可能会被激活，导致过度的骨质破坏和肿瘤的进一步扩散。
• CAFs：这是Cancer-associated fibroblasts（癌相关成纤维细胞）的缩写，它们是肿瘤微环境中的一种重要细胞类型。CAFs可以通过分泌生长因子、细胞因子和基质蛋白来促进肿瘤的生长、侵袭和转移。同时，CAFs还可以通过影响免疫细胞的功能来帮助肿瘤细胞逃避免疫系统的攻击。

并且分别展示了各个细胞亚群的marker基因

对成骨骨肉瘤细胞进行UMAP降维分析，鉴定出5个不同的亚组,并且给出了对应的marker基因

• C1_osteoblastic OS cells
• C2_osteoblastic OS cells
• C3_osteoblastic OS cells
• C4_osteoblastic OS cells
• C5_osteoblastic OS cells

其它加分项

为了研究数据中成骨骨肉瘤细胞的起源、分化和发育，对成骨骨肉瘤细胞进行了轨迹和RNA速度分析。

结果显示在发育轨迹的起始位置存在部分c1_成骨OS细胞，表明部分C1_osteoblastic OS细胞具有向其他细胞亚型分化的能力。

OCs（破骨细胞）是由造血巨噬细胞/单核细胞系的前体细胞衍生的多核巨细胞。文章中根据其特定的基因表达谱获得了四种不同类型的OC，并将其重新命名。这四种主要的细胞类型包括前体细胞、成熟细胞、低功能细胞和无功能的破骨细胞。

为了描述细胞间关系的分子联系，使用CellPhoneDB用于分析成骨OS细胞、OCs和CAFs之间的细胞通讯。CellPhoneDB分析用于鉴定配体-受体对与主要细胞类型之间的分子相互作用，以构建细胞通信网络。

文章共鉴定出9种主要的细胞类型，并揭示了OS的单细胞转录图谱。将鉴定的成骨骨肉瘤细胞分为5个亚群，并使用反卷积算法确定具有显著预后相关性的成骨骨肉瘤细胞亚群。