肿瘤相关成纤维单细胞亚群的iCAF和myCAF迷思

肿瘤相关成纤维（Cancer-Associated Fibroblasts，CAFs）是存在于肿瘤微环境中的一种细胞类型，起着重要的调控和支持作用。最近的研究表明，CAFs并非是一个均一的细胞群体，而是包含多个亚群体，其中每个亚群体可能具有不同的功能和表型。单细胞技术的发展使得科学家们能够更详细地研究和理解肿瘤相关成纤维的单细胞亚群。因为肿瘤领域的单细胞技术火爆，肿瘤微环境里面的免疫相关（不管是淋巴系还是髓系）都有了大量的 成果。反而是肿瘤微环境里面的基质细胞，比如内皮细胞，成纤维和周细胞目前还大有可为。

通常我们拿到了肿瘤相关的单细胞转录组的表达量矩阵后的第一层次降维聚类分群通常是：

• immune (CD45+,PTPRC),
• epithelial/cancer (EpCAM+,EPCAM),
• stromal (CD10+,MME,fibro or CD31+,PECAM1,endo)

参考我前面介绍过 CNS图表复现08—肿瘤单细胞数据第一次分群通用规则，这3大单细胞亚群构成了肿瘤免疫微环境的复杂。绝大部分文章都是抓住免疫细胞亚群进行细分，包括淋巴系（T,B,NK细胞）和髓系（单核，树突，巨噬，粒细胞）的两大类作为第二次细分亚群。但是也有不少文章是抓住stromal 里面的 fibro 和endo进行细分，并且编造生物学故事的。

前面我们已经介绍了心肝脾肺肾等多个器官的上皮细胞的细分亚群， 以及免疫细胞里面的髓系和B细胞细分亚群：

• B细胞细分亚群
• 髓系免疫细胞细分亚群

在进行这些细分亚群的时候，很容易出现知识点混乱，比如2023年5月某院士团队发表在顶刊的文章：《Epithelial cells activate fibroblasts to promote esophageal cancer development》，就是出现了肿瘤相关成纤维单细胞亚群的iCAF和myCAF迷思。

第一层次降维聚类分群

可以看到是17万多的细胞，样品分属于4个不同疾病进展组，然后第一层次降维聚类分群是7大亚群：

• a total of 176,492 cells across all stages, i.e., NOR (n = 99,140), LGIN (n = 24,023), HGIN (n = 18,502), and ESCC (n = 34,827)
• seven major cell types, i.e., epithelial cells (n = 5,218), fibroblasts (n = 28,530), endothelial cells (n = 14,388), T cells (n = 63,332), B cells (n = 38,220), myeloid cells (n = 21,627), and mast cells (n = 5,177)

第一层次降维聚类分群是7大亚群

第二层次的降维聚类分群如果是看成纤维单细胞的细分亚群，作者这个时候把在疾病进展早期的成纤维划分为normal fibroblasts (NFs) ，然后在晚期的是肿瘤相关成纤维（Cancer-Associated Fibroblasts，CAFs），如下所示：

成纤维单细胞的细分亚群

因为作者的假设是 cancer cells can ‘‘educate’’ quiescent normal fibroblasts (NFs) into CAFs, facilitating cancer expansion and metastasis，上面的肿瘤相关成纤维（Cancer-Associated Fibroblasts，CAFs）区分成为了 iCAF和myCAF

但是如果我们具体看这些亚群的基因，会发现所谓的iCAF可能是周细胞，而myCAF就是平滑肌细胞啦 ：

iCAF可能是周细胞，而myCAF就是平滑肌细胞

这样就很尴尬，整篇文章的落脚点就是iCAF和myCAF随着疾病进展的比例变化，生物学功能改变，基因表达量变化。如果说iCAF可能是周细胞，而myCAF就是平滑肌细胞，那么文章的价值就大打折扣了。

成纤维，平滑肌，周细胞，内皮细胞

之前我们重新分析了中大五院泌尿外科赵亮宇博士后所在的中大五院/上海交通大学附属第一人民医院联合课题组在国际顶尖期刊《Nature Communications》发表的关于人阴茎海绵体单细胞的研究论文，讨论了里面的关于成纤维内皮周细胞平滑肌细胞的细分问题。文章里面选取了 KCNJ8和ACTA2进行代表平滑肌，周细胞：

• VWF (endothelial cells)
• PDGFRA (fibroblast)
• KCNJ8 (pricytes)
• ACTA2 (smooth muscle cells)

文章后续继续对成纤维，内皮，周细胞，平滑肌细胞的细分的时候，文章里面的平滑肌细胞的细分里面又一次出现了周细胞，这个时候的RGS5基因代表的周细胞是我们比较熟悉的了。

其它可能的误区

前面提到了：肿瘤样品的单细胞需要提取上皮细胞继续细分，就是感兴趣的fibroblasts等细胞亚群占比非常少，所以研究者们做了第二次单细胞转录组数据，见：什么，你想要的单细胞亚群比例太少了？，其实这样的策略屡见不鲜。在小鼠模型里面也有：4T1这个TNBC小鼠肿瘤模型的CAFs异质性，其实大家并不能很好的确定自己研究的对象就是成纤维细胞。比如这个 肿瘤相关成纤维细胞异质性 就是分成了6群：

• Subcluster 0 被作者定义为 vascular CAFs ，高表达 GJA4, and RGS5 等
• Subcluster 1 被作者定义为 matrix CAFs ，高表达 LUM, DCN, and VCAN等
• Subcluster 2 被作者定义为 inflammatory CAFs ，高表达 complement genes (C3 and C7). 等
• Subcluster 3 被作者定义为 antigen-presenting CAFs ，高表达CD74, HLA- DRA, and HLA-DRB1 等
• Subcluster 4 被作者定义为 EMT-like CAFs ，高表达 KRT19, KRT8 等
• Subcluster 5 被作者定义为 lip- ofibroblast–c5–FABP1 ，高表达APOA2, FABP1, FABP4, and FRZB等

如果按照其它理论，会认为所谓的 vascular CAFs ，高表达 GJA4, and RGS5 等，其实是周细胞，而 EMT-like CAFs ，高表达 KRT19, KRT8 ，可能都不一定是一个真正的单细胞亚群。