外周血单细胞RNA测序揭示阿尔茨海默病的免疫细胞特征
外周血单细胞RNA测序揭示阿尔茨海默病的免疫细胞特征
文章概述
文章标题：《Single-Cell RNA Sequencing of Peripheral Blood Reveals Immune Cell Signatures in Alzheimer’s Disease》
发表日期和杂志：2021年发表在Frontiers in Immunology上
在线阅读链接：https://doi.org/10.3389%2Ffimmu.2021.645666
实验设计与疾病简介
使用了来自AD和两种NC患者的新鲜PBMC，在单细胞5'基因表达测序并汇总cell Ranger的所有样本数据后，我们最终获得36849个单细胞，包括22775个AD患者细胞和14074个NC患者细胞。
单细胞转录组数据情况
数据链接是：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE181279
GSM5494107 AD1_GEX
GSM5494108 AD1_BCR
GSM5494109 AD1_TCR
GSM5494110 AD2_GEX
GSM5494111 AD2_BCR
GSM5494112 AD2_TCR
GSM5494113 AD3_GEX
GSM5494114 AD3_BCR
GSM5494115 AD3_TCR
GSM5494116 NC1_GEX
GSM5494117 NC1_BCR
GSM5494118 NC1_TCR
GSM5494119 NC2_GEX
GSM5494120 NC2_BCR
GSM5494121 NC2_TCR
提供了10X标准格式的三个文件，不过我们直接下载后按照数据集整理对应的文件，使用Read10X()函数读取即可。
GSM5494107_AD1_barcodes.tsv.gz 36.6 Kb
GSM5494107_AD1_features.tsv.gz 302.7 Kb
GSM5494107_AD1_matrix.mtx.gz 44.2 Mb
GSM5494110_AD2_barcodes.tsv.gz 38.3 Kb
GSM5494110_AD2_features.tsv.gz 302.7 Kb
GSM5494110_AD2_matrix.mtx.gz 40.9 Mb
GSM5494113_AD3_barcodes.tsv.gz 35.9 Kb
GSM5494113_AD3_features.tsv.gz 302.7 Kb
GSM5494113_AD3_matrix.mtx.gz 40.8 Mb
GSM5494116_NC1_barcodes.tsv.gz 34.8 Kb
GSM5494116_NC1_features.tsv.gz 302.7 Kb
GSM5494116_NC1_matrix.mtx.gz 32.6 Mb
GSM5494119_NC2_barcodes.tsv.gz 34.0 Kb
GSM5494119_NC2_features.tsv.gz 302.7 Kb
GSM5494119_NC2_matrix.mtx.gz 31.2 Mb
数据整理：下载数据，然后按照数据集名称对应的整理
fs=list.files('./','features.tsv.gz')
fs
samples1=gsub('-features.tsv.gz','',fs)
samples1
library(stringr)
samples2= gsub('-filtered','',samples1)
samples2
lapply(1:length(samples2), function(i){
x=samples2[i]
y=samples1[i]
dir.create(x,recursive = T)
file.copy(from=paste0(y,'-features.tsv.gz'),
to=file.path(x, 'features.tsv.gz' ))
file.copy(from=paste0(y,'-matrix.mtx.gz'),
to= file.path(x, 'matrix.mtx.gz' ) )
file.copy(from=paste0(y,'-barcodes.tsv.gz'),
to= file.path(x, 'barcodes.tsv.gz' ))
})
读取数据，创建seurat结构进行后续的分析。
###### step1:导入数据 ######
library(data.table)
dir='GSE181279_RAW/outputs/'
samples=list.files( dir )
samples
# samples = head(samples,10)
sceList = lapply(samples,function(pro){
# pro=samples[1]
print(pro)
sce =CreateSeuratObject(counts = Read10X(file.path(dir,pro )) ,
project = gsub('^GSM[0-9]*_','',pro) ,
min.cells = 5,
min.features = 500 )
return(sce)
})
names(sceList)
# gsub('^GSM[0-9]*','',samples)
sce.all=merge(x=sceList[[1]],
y=sceList[ -1 ],
add.cell.ids = gsub('_gene_cell_exprs_table.txt.gz','',gsub('^GSM[0-9]*_','',samples) ) )
as.data.frame(sce.all@assays$RNA$counts[1:10, 1:2])
head(sce.all@meta.data, 10)
table(sce.all$orig.ident)
#确定分组信息
sce.all$group=toupper( substring(colnames(sce.all),1,2))
table(sce.all@meta.data$group)
table(sce.all@meta.data$orig.ident)
在批量读取数据之前，一般要先读取一个数据用来进行测试，确认无误后，再使用循环批量读取全部的数据用于后续的分析。
后面就是标准分析啦,对读取进来的数据进行质控、harmony整合以及细分亚群定义等。
第一层次降维聚类分群
使用t-SNE分析在二维空间中可视化细胞，发现21个簇代表不同的细胞类型。鉴定了五种主要的免疫细胞类型
- CD4+T细胞：具有典型标记基因CD3D、CD3E、CD3G和CD4（簇1、2、3、4、5、6、7和8）
- CD8+T细胞：具有标记基因CD3D、CD3E、CD3G、CD8A和CD8B（簇9、10、11、12和13）
- B细胞：具有标记基因CD19、CD79A和CD79B（簇14、15和16）
- 自然杀伤（NK）细胞：具有标记基因NKG7、GZMB、GNLY和NCR1（簇17、18和19）
- 单核细胞-巨噬细胞：具有标记基因CD14和CD68（簇20）
并且发现AD和NC在t-SNE图中是分离的，这表明基因表达模式存在主要差异。
与NC相比，AD组CD4+T细胞数量显著增加。相反，AD组CD8、NK和单核巨噬细胞的比例显著低于NC。B细胞的比例在两组之间没有显著差异。
其它加分项
分别筛选了AD组和NC组(| log2fc | >0.5)和FDR <0.05)各类型免疫细胞的差异表达基因，使用圆环图显示来自多个基因的基因列表从五个免疫细胞重叠子集。
通过富集分析找到了前20个显著丰富的术语
为了进一步捕获丰富术语之间的关系，选择了丰富术语的子集，并将其呈现为相似性网络。
使用Metascape构建PPI网络
整合了不同免疫细胞簇的差异表达基因，剔除重叠基因后，共获得436个基因。为了描述这些基因之间的相互作用，使用Metascape构建了一个PPI网络。
根据程度排序法选择了前40个基因进行子网络分析，并使用MCODE算法确定了三个模块具有显著意义，这三个模块包含31个基因，它们被确定为关键基因。
对T细胞和B细胞进行了受体谱系分析
T细胞
B细胞
文章小结
- 通过单细胞数据分析归类了5个免疫细胞亚群:CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、B细胞、自然杀伤细胞和单核-巨噬细胞，并揭示了AD中细胞亚群比例和基因表达模式的特征性改变。
- 通过蛋白-蛋白相互作用网络和途径富集分析，鉴定出31个细胞类型特异性关键基因，包括丰富的人白细胞抗原基因和多种免疫相关通路。
- 还发现AD患者T细胞和B细胞的高频扩增克隆型和T细胞多样性降低。由于克隆扩增提示了针对特定抗原的适应性免疫反应的激活，推测外周适应性免疫反应，特别是T细胞介导的适应性免疫反应可能在AD的发病机制中起作用。