Day7-学习笔记（2023年2月4日）测序

今日学习解决问题

1、怎么区分一二三代测序

2、二代测序大体流程

3、NGS组学都包括哪些分类（粗略）

illuminate二代测序 原理及大体流程

原理介绍视频：https://share.weiyun.com/5qojuBY 密码： 密码：bxsry4

文章《测序的世界》：https://www.jianshu.com/p/101c14c3a1d2

技术原理：可逆终止的、荧光标记的dNTP，边合成边测序

流程（4步）：样本准备，簇生成，测序，数据分析。

一、样本准备(Sample Prep)/文库构建

DNA文库：

定义：其实就是许多 DNA 片段，在两头接上了特定的DNA接头，形成的DNA混合物。

特点：中间插入的 DNA 序列是各不相同的；而两头的接头序列是已知的，且是人工特地加上去的。

制作方法：先将DNA片段化，即把基因组 DNA 用超声波打断，打断之后在两端用酶补平，再用 Klenow 酶在 3’ 端加上一个A碱基，再用连接酶把特定接头（adapter）连上去，连好接头的这堆DNA混合物，我们称之为“文库”（library）。

接头（adapter）：

样本准备方法有很多种，不过所有的制备方法都会在 DNA 片段的末端加接头（adapter），以便它们能够和测序流程中所需的引物和平台兼容。

接头是一系列特定的寡核苷酸序列，它们在测序的不同阶段发挥关键作用，通常包含以下内容：

①P5 和 P7 适配器序列：这些是 Illumina 平台上使用的两种常见适配器。P5 适配器位于测序读取的一端，而 P7 适配器位于另一端。在测序时，flowcell oligo 会与 DNA 片段上的 P5 和 P7 适配器序列结合，使 DNA 片段固定在 flowcell上，从而允许进行测序反应。

②DNA barcode 或 index 序列：DNA barcode 也称为 index（复数为 indices），是一个独特的短序列，用于将不同样本标识，允许在同一测序流程中混合多个样本。这对于高通量测序非常有用，因为它允许同时处理多个样本，而不需要单独测序。

③PCR 引物结合序列：接头还包含用于引物结合的序列。PCR 引物是在扩增步骤中使用的特定 DNA 序列，有助于将 DNA 片段进行增加复制，使其在测序过程中变得更加丰富。

二、簇生成

簇生成就是每个DNA片段被扩增的过程。

为什么要扩增？

其实就是为了增强信号！单个DNA文库序列释放的荧光信号会很微弱，不容易被检测到，扩增后使得荧光信号被放大，更易被捕捉。不然为什么要叫 cluster 呢，因为发光的是一簇嘛！我们可以理解为一个簇对应 fastq 中一条 read。

簇生成的过程就在 flowcell（如下图）上：

Flowcell（流动池）：

8条通道，lane的内表面→化学修饰→2种DNA引物（它们被种在 flowcell 的表面，也就是我们前面提到的 flowcell oligo）→与待测序DNA文库的接头序列相互补→通过共价键连到flowcell上防止被液体冲掉。

桥式PCR：

把文库种到芯片上去→互补杂交（文库两头的DNA接头序列与芯片引物互补）→加入dNTP和酶→产生新链→加NaOH碱溶液→DNA双链解链→原链洗去，留下互补链（因为原始模板链没有和芯片共价键连接，所以被冲走）→加入中性液体中和碱液→DNA上的另外一端与玻璃板上的第二种引物互补杂交→加入酶和dNTP→加碱→加中和液体→重复过程进行扩增

illumina采取了“一次加一个荧光碱基，用完失效”的办法。官网给出的解释如下图：【有没有感觉和Sanger的方法很像？illumina的测序就是在Sanger基础上加上了桥式PCR，能克服Sange低通量的缺点】

三、测序

边合成边测序

把合成的双链变成可以测序的单链→化学反应→切断一个引物上的特定基团（拿掉互补链的，使得互补链被切断洗去，仅留下正向链，即模板链，也就是目的片段。）→碱溶液洗芯片剩下一个链→加中性溶液与测序引物（带荧光标记的dNTP→3'末端被一个叠氮基堵住→一个循环只能延长一个碱基，聚合酶→选择与原来位置上碱基互补的dNTP）→用水把多余的dNTP和酶冲掉→放到显微镜下进行激光扫描→根据发出来的荧光判断碱基类型（4种dNTP）

一个循环结束后，加入化学试剂切掉叠氮基团和旁边标记的荧光集团→暴露3'端羟基→再加入新的dNTP和新酶→再次延长一个碱基→继续进行延长，不断反复这个过程。

在第一次 read 读段结束后，我们就要开始进行 index 的读取。

index：

在文库的接头上做标记，样本特定接头上的特定序列标记了样本的来源

读index：碱解链read1DNA→加入中性液→加入read2测序引物（结合位点正好在index序列旁边）→进行2轮测序（一般为6到8个碱基）→了解某一个具体的一段DNA来自于原始的哪个样本

双端测序（ Illumina 测序的另一个核心技术）：一根DNA链正反向各读一遍，增加一倍测序的有效长度

四、数据分析

前面的过程产生了数百万个 reads，代表所有的片段。来自样本文库的序列通过在文库构建过程中引入的独特 index 进行分离。

对于每个样本，具有相似延伸的 base calls 会被聚类。正向和反向 reads 被配对生成连续序列。

这些连续序列与参考基因组进行比对，用于突变识别。

一二三代测序对比

1.基因组学（核酸序列分析）

（1）全基因组测序（WGS）

（2）全外显子组测序（WES）

（3）简化基因组测序（RRGS）

①RAD-Seq

②GBS

③2bRAD

④ddGBS（也就是ddRAD）

作用：

（1）基因组作图（遗传图谱、物理图谱、转录本图谱）

（2）核苷酸序列分析

（3）基因定位

（4）基因功能分析

其它：

以全基因组测序为目标的结构基因组学

以基因功能鉴定为目标的功能基因组学

2.转录组学（基因表达分析）

（1）mRNA-Seq

（2）IncRNA-Seq（长链非编码RNA）

（3）sRNA-Seq（主要是miRNA-Seq）

作用：

（1）获得物种或者组织的转录本信息

（2）得到转录本上基因的相关信息，如基因结构功能等

（3）发现新的基因

（4）基因结构优化

（5）发现可变剪切

（6）发现基因融合

（7）基因表达差异分析

3.蛋白质组学

（1）蛋白质组数据处理、蛋白及其修饰鉴定

（2）构建蛋白质数据库、相关软件的开发和应用

（3）蛋白质结构功能预测

（4）蛋白质连锁图

4.代谢组学

（1）代谢物指纹分析

（2）代谢轮廓分析

测序技术

DNA序列表征：

A =腺嘌呤，C =胞嘧啶 ，G =鸟嘌呤 ，T =胸腺嘧啶，U =尿嘧啶，R = GA（嘌呤） ，Y = TC（嘧啶），K = GT（酮），M = AC（氨基），S = GC，W = AT，B = GTC，D = GAT，H = ACT，V = GCA，N = AGCT（任何）

一、Fastq & Fasta

Fastq格式：一种基于文本的，保存生物序列（通常是核酸序列）和其测序质量信息的标准格式,一般都包含有4行。

第一行：由‘@’开始，后面跟着序列ID和可选的描述，序列ID是唯一的；

第二行：碱基序列；

第三行：由‘+’开始，后面是序列的描述信息；

第四行：第二行序列的质量评价(quality value)。

举例：

@HISEQ:777:HCMCVBCX2:1:1101:4712:2186 1:N:0:TACTCCAG

HISEQ：仪器 ID

777：Run ID

HCMCVBCX2：FlowCell ID

1：The lane number

1101：流通池道内的tile号码

4712：瓦片中的集群的‘x'坐标

2186：瓦片中的集群的’y'坐标

1：成对的成员，1或2（配对结束或配对读取）

N：如果读取过滤，则为Y；否则为N

0：当没有控制位开启时为0，否则为偶数

TACTCCAG：索引序列

Fasta格式：

1：以“>”为开头，fasta格式标志。

2：序列ID号，gi号，NCBI数据库的标识符，具有唯一性。

格式为：gi|gi号|来源标志|序列标志（接收号、名称等），若某项缺失可以留空，“|”保留。

3：序列描述。

4：碱基序列，序列中允许空格、换行、空行，一般一行60个。

Fastq文件→Fasta文件

Linux命令

法1：sed '/^@/!d;s//>/;N' your.fastq > your.fasta

法2：seqtk seq -A input.fastq > output.fasta

FASTX-Toolkit

•一款用于处理Short-Reads FASTA/FASTQ文件的程序，里面包含了丰富的Fasta/Fastq文件格式转换、统计等命令。

http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/

二、GenBank & EMBL

GenBank格式

以LOCUS和一些注释行开始。

序列的开头以“ORIGIN”标记，末尾以“//”标记。

EMBL格式

以标识符行（ID）开头，后面跟着更多注释行。

序列的开头以“SQ”开头标记，序末尾以“//”标记。

表1 GenBank & EMBL数据库格式的对比

EMBL → Fasta格式转换（在线工具）：http://www.geneinfinity.org/sms/sms_embltofasta.html

另外介绍一个常见测序文件格式解析的网站：https://genome.ucsc.edu/FAQ/FAQformat.html#format1

该网站包含了各种各样的测序文件格式说明，想了解文件格式各行各列的含义直接找它即可。

测序技术原理及常用数据格式简介

DNA 测序技术的发展：第三代测序法

测序发展史：150年的风雨历程

B站【陈巍学基因】视频集学习