通过单细胞图谱改进结直肠癌分类和临床分层
文章概述
文章标题：《Refining colorectal cancer classification and clinical stratification through a single-cell atlas》
发表日期和杂志：2022年发表在Genome Biology上
在线阅读链接：https://doi.org/10.1186/s13059-022-02677-z
疾病简介及实验设计
疾病简介
结直肠癌(CRC)共识分子亚型(CMS)具有不同的免疫学、间质细胞和临床病理特征。CMS亚型肿瘤微环境的单细胞特征是阐明肿瘤和基质细胞在发病机制中的作用机制所必需的，这可能会促进亚型特异性治疗的开发。
结直肠癌是一种常见的恶性肿瘤，起源于结肠或直肠的内膜细胞。发病机制复杂，可能与遗传因素、饮食习惯、生活方式和环境因素等多种因素有关。常见的症状包括肠道变化（如便秘、腹泻、便血）、腹痛、腹胀、体重下降和疲劳等。
实验设计
为了确定和解剖结直肠癌患者的肿瘤、免疫学和基质异质性程度，我们对16个种族不同的治疗naïve结直肠癌患者组织样本和7个相邻的正常结肠组织样本(共23个样本)进行了基于液滴的scRNA-seq。严格的质量控制产生了49,589个高质量的单细胞，用于进一步分析
单细胞转录组数据情况
数据链接是：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE200997
#samples
GSM6048346 Patient 1, Tumor, Right Side colon cancer
GSM6048347 Patient 2, Tumor, Left Side colon cancer
GSM6048348 Patient 3, Tumor, Right Side colon cancer
GSM6048349 Patient 4, Tumor, Left Side colon cancer
GSM6048350 Patient 5, Tumor, Right Side colon cancer
GSM6048351 Patient 6, Tumor, Left Side colon cancer
GSM6048352 Patient 7, Tumor, Right Side colon cancer
GSM6048353 Patient 8, Tumor, Right Side colon cancer
GSM6048354 Patient 9, Tumor, Left Side colon cancer
GSM6048355 Patient 10, Tumor, Left Side colon cancer
GSM6048356 Patient 11, Tumor, Right Side colon cancer
GSM6048357 Patient 12, Tumor, Right Side colon cancer
GSM6048358 Patient 13, Tumor, Right Side colon cancer
GSM6048359 Patient 14, Tumor, Left Side colon cancer
GSM6048360 Patient 15, Tumor, Left Side colon cancer
GSM6048361 Patient 16, Tumor, Left Side colon cancer
GSM6048362 Patient 4, Normal, Left Side colon cancer
GSM6048363 Patient 6, Normal, Left Side colon cancer
GSM6048364 Patient 7, Normal, Right Side colon cancer
GSM6048365 Patient 10, Normal, Left Side colon cancer
GSM6048366 Patient 11, Normal, Right Side colon cancer
GSM6048367 Patient 14, Normal, Left Side colon cancer
GSM6048368 Patient 15, Normal, Left Side colon cancer
#数据情况
GSE200997_GEO_processed_CRC_10X_raw_UMI_count_matrix.csv.gz 68.0 Mb
提供的是csv.gz格式的压缩文件，下载数据之后解压开来使用fread函数读取
#读取数据并整理分组信息
ct=fread( 'GSE200997_GEO_processed_CRC_10X_raw_UMI_count_matrix.csv.gz',data.table = F)
ct[1:4,1:4]
ct[nrow(ct),1:4]
rownames(ct)=ct[,1]
ct=ct[,-1]
ct[1:4,1:4]
sce.all = CreateSeuratObject(counts = ct ,
min.cells = 5,
min.features = 500 )
as.data.frame(sce.all@assays$RNA@counts[1:10, 1:2])
head(sce.all@meta.data, 10)
table(sce.all@meta.data$orig.ident)
phe=str_split( colnames(sce.all) ,'_',simplify = T)
head(phe)
table(phe[,1])
table(phe[,2])
table(phe[,2],phe[,1])
sce.all$group=sce.all$orig.ident
sce.all$orig.ident=paste(phe[,2],phe[,1])
head(sce.all@meta.data)
table(sce.all@meta.data$group)
table(sce.all@meta.data$orig.ident)
后面就是标准分析啦,对读取进来的数据进行质控、harmony整合以及单细胞细分亚群定义等。
第一层次降维聚类
基于图形的合并和标准化细胞的聚类根据典型的标记基因确定了强健的、离散的上皮细胞(EpCAM+、KRT8+和KRT18+)、成纤维细胞(COL1A1+)、内皮细胞(CLDN5+)、T细胞(CD3D+)、B细胞(CD79A+)和髓样细胞(LyZ+)的簇
其他主要分析概述
肿瘤上皮细胞表现出瘤内CMS的异质性并驱动免疫基质细胞的侵袭
在批量校正和归一化后，进行伪批量差异表达分析，然后利用scRNA-seq数据进行CMS之间的通路分析
在肿瘤上皮细胞内，CMS亚组之间共享多种关键通路，如血管生成、炎症、WNT通路激活，假设这可能是由于肿瘤内细胞分化/可塑性的肿瘤内异质性。
为了验证假设，应用了两种独立的轨迹分析方法(Monocle 2和Slingshot)来推断潜在的配对或谱系关系(CMS指定)
肿瘤微环境中的CAF具有不同的表型
结直肠癌微环境中癌症相关成纤维细胞(CAF)潜在的异型相互作用，CAF的异质性及其与CMS的关系还没有在单细胞水平上进行评估。在重新聚类和分析高质量的成纤维细胞时，在所有四个数据集中识别并按表型将CAF分为粘连/创伤愈合/CAF-S1、血管周围/CAF-S4亚型
对来自乳腺癌(BC)队列的五种CAF亚型进行整合分析，以验证特定CAF亚型在结直肠癌样本中的存在。
在5例独立患者的结直肠癌切片上，有代表性的CAF-S1(FAP+，PDGFR-ç+)和CAF-S4(RGS5+，MCAM+)图像
肿瘤相关巨噬细胞是结直肠癌中肿瘤抑制的M2极化细胞
为了检查髓系室，重新聚集了这些细胞，并在所有四个数据集中鉴定了CD1C+树突状细胞，肿瘤相关巨噬细胞(C1Q+ tam, MRC1+)，单核细胞(S100A8+)和粒细胞簇
D8+和CD4+T细胞的不同状态塑造了结直肠癌生态系统
CRC患者免疫寒冷或缺乏明显程度的免疫细胞渗透，免疫检查点阻断形式的免疫治疗并未提高这些患者的存活率。对T细胞的分析确定了11个CD4+T细胞和10个CD8+T细胞簇，每个簇由来自多个样本的细胞填充，这意味着在CRC中存在共享状态
还鉴定了自然杀伤细胞(NK细胞)和天然淋巴样细胞(ILC)簇
通过对单细胞转录数据分析发现CMS组中T细胞的浓缩
免疫性肿瘤(CMS1)和间充质细胞亚型(CMS4)表现出较强的T细胞浸润，而CMS2和CMS3则表现出较低的T细胞浓集，这与以往的数据一致。CMS1主要表达于NK细胞和CD8+TRM细胞。
CAFS和TAMs对结直肠癌免疫抑制的调节作用
使用cellphoneDB(一个人工整理的受体、配体及其相互作用的数据库)，发现CAF和C1q+ TAM相互作用导致与T细胞功能障碍和m2样极化相关的特征
研究了不同基质亚型如何与tam和CD8+ T细胞相互作用，观察到CAF亚型和各种CD8+ T细胞之间存在不同的和共同的免疫检查点相互作用
通过MIF-CD74的cafa - tam相互作用增加了CAFs中CD44的结合，导致ERK1/2活化，从而促进增殖和抑制凋亡
文章小结
- 文章分析揭示影响每个CMS组免疫和间质细胞渗透的独特的肿瘤细胞固有特征
- 在单个细胞分辨率下每个CMS中构成肿瘤微环境的细胞的作用
- 确定推动临床结果的细胞群，包括不同的肿瘤相关成纤维细胞(CAF)和免疫抑制的肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)亚型