整合单细胞和bulk RNA数据确定心力衰竭的关键细胞类型和生物标志物

文章概述

基本信息

文章标题：Key Cell Types and Biomarkers in Heart Failure Identified through Analysis of Single-Cell and Bulk RNA Sequencing Data【整合单细胞和bulk RNA数据确定心力衰竭中的关键细胞类型和生物标志物】

发表时间：2023-12-26

发表杂志：Mediators of Inflammation

影响因子：3.578

在线阅读链接：

https://www.hindawi.com/journals/mi/2023/8384882/

文章摘要

背景：心力衰竭（HF）是一种复杂的临床综合征，由各种心脏疾病引起，是世界范围内的重大医学问题。尽管炎症在 HF 发病机制中的作用是众所周知的，但所涉及的特定细胞类型和调控分子仍然知之甚少。

方法与结果：作者通过分析两种主要类型的HF，缺血性心肌病和扩张型心肌病患者的单细胞和bulk RNA 测序数据来鉴定关键细胞类型和新型生物标志物。通过细胞组分和基因集富集分析，将髓样细胞鉴定为参与 HF 的原代细胞群。对髓样细胞的差异分析揭示了 HF 中细胞通讯和细胞因子调节免疫反应之间的交互，MIF 通路成为关键的免疫调节通路。髓系细胞亚群 Mφ2 中的 CD74/CXCR4 受体复合物显著上调，可能作为 HF 中的关键调节因子。CD74/CXCR4 受体在接收到 MIF 信号分子后，可以激活NF-κB信号传导产生趋化因子，从而增强炎症反应。

结论：CD74 和 CXCR4 可作为 HF 的生物标志物和治疗靶点。

疾病简介与实验设计

疾病简介

心力衰竭（heart failure， HF）是一种复杂的临床综合征，会损害心脏功能，导致血液泵血能力欠佳，无法满足身体的代谢需求。心衰通常是多种心血管疾病的终末期，可能由多种心脏疾病引发，其中缺血性心肌病（ICM）和扩张型心肌病（DCM）是主要病因。HF患者根据 LVEF（左心室射血分数）的分类接受个体化和精确的治疗策略，这需要更深入地了解 HF 的病理生理学以及相关的转录组学和遗传机制。

早期的研究表明，不平衡炎症在心衰的病理生理学中起着至关重要的作用，单核细胞和巨噬细胞在维持心脏稳态和免疫防御方面起着至关重要的作用。巨噬细胞可能极化为具有促炎能力的M1表型或具有抗炎功能的M2表型。由于压力超负荷导致的左心室重塑不良需要来源于 CCR2 + 单核细胞的心巨噬细胞。这些分析表明，功能异质的巨噬细胞亚群存在于心脏的免疫微环境中，并促进了 HF 的发生。然而，涉及的具体机制和巨噬细胞亚群尚不清楚。

单细胞RNA测序（scRNA-seq）可以在分子水平上检查参与 HF 的细胞群，并研究不同细胞亚群之间的相互作用如何受到配体-受体（L-R）的调节。对压力超负荷小鼠心血管免疫微环境的研究表明，免疫激活涉及多种细胞类型。例如，CD72 hi 巨噬细胞释放促炎因子导致心脏损伤，这表明靶向 CD72 hi 巨噬细胞可能是 HF 的一种新治疗策略。还为 HF 患者构建了高分辨率的单细胞图谱，用于分析免疫细胞群，但样本量较小，这限制了分析范围。在这里，通过对scRNA-seq和bulk RNA-seq数据的联合分析，阐明了在 HF 发病机制中起重要作用的关键细胞类型和细胞类型特异性基因。

样本

• 一项来自心脏和血液的单细胞RNA-seq数据集（GSE145154）包含1个正常样本、2个DCM样本和3个ICM样本。
• 三个批量RNA-Seq数据集包括正常、DCM和ICM样本：GSE79962、GSE5406 和 GSE57338。
• GSE141910数据集，包括DCM和正常样本以及记录的LVEF信息，用于进一步的分析和验证。

分析流程图

文中对包含 ICM 和 DCM 的 HF 样品进行了生物信息学分析（图 1），以探索参与 HF 的关键细胞类型并确定潜在的生物标志物。

• 首先通过scRNA-seq数据中的聚类分析来鉴定参与HF的髓系细胞，以识别细胞类型，比较不同组之间的细胞组分，并使用大量RNA-seq数据进行基因集富集分析（GSEA）。
• 然后，分析了各组骨髓细胞的差异表达，并使用Metascape探索了这些基因在差异表达中的功能。
• 对细胞相互作用的进一步分析表明，MIF信号通路中的分子在HF中显着上调，并可能作为有价值的生物标志物。
• 最后，以更高的分辨率重新聚类骨髓细胞，以研究髓系细胞亚型的异质性及其潜在的分化关系。

研究结果

单细胞图谱揭示了HF患者免疫细胞的异质性

作者首先使用scRNA-seq数据集比较了健康个体和HF患者之间的差异。经过严格的质量控制筛选，保留了 126,667 个细胞，使用 UMAP 和聚类分析将其分为 25 个聚类。通过评估每个簇中经典细胞特征基因的存在和丰度，鉴定了10个细胞簇（图2（a））和三种样品类型（图2（b））。然后使用点图来描述10个簇中每个簇的特征标记的表达水平。这些簇被鉴定为（图2（d））：

• T 细胞（CD3D、CD3E 和 CD3G）
• 自然杀伤 （NK） 细胞（FCGR3A 和 KLRB1）
• B 细胞（CD79A、CD79B 和 BANK1）
• 髓样细胞（LYZ、C1QC 和 C1QB）
• 内皮细胞 （EC）（VWF、TAGLN 和 CLDN5）
• 心内膜细胞（LUM 和 DCN）
• 成纤维细胞 （FB）（LUM 和 DCN）
• 周细胞（VWF、TAGLN 和 CLDN5）
• 平滑肌细胞 （SMC） （MYH11）
• 心肌细胞（MYH7和MYL2）

然后根据各自的样品来源（正常、DCM 和 ICM）用三种颜色（绿色、蓝色和红色）对 10 个细胞簇进行着色 [图 2（b）]。如图2（b）所示，DCM中的细胞分布与ICM中的细胞分布相似。然而，健康人群的细胞组成与心衰患者的细胞组成不同。此外，通过分析每个样本组的 10 个细胞簇的百分比，发现 HF 样本的 EC、成纤维细胞和髓样细胞的百分比显着降低，而 T 细胞和 NK 细胞的百分比显著更高 [图 2（c）]。

接下来，对 scRNA-seq 和 bulk RNA-seq 数据（GSE79962、GSE5406 和 GSE57338）进行了系统分析，以进一步鉴定与 HF 相关的细胞类型。由于 HF 患者骨髓细胞的数量显著减少，因此在 bulk 数据集中进行了 GSEA 以探索髓系细胞标志物的富集。值得注意的是，DCM 和 ICM 中下调的基因显示出来自髓样细胞的标记基因的显着富集（见补充材料 1）。

单细胞表达谱中髓系细胞的差异基因表达分析

文中通过进行差异基因表达分析来鉴定和比较 DCM/ICM 与正常对照之间髓系细胞中失调基因，从而研究 HF 的潜在失调机制。在 DCM 中鉴定出显着差异表达的 275 个上调和 185 个下调基因 [图 3（a）]。在 ICM 中，163 和 105 个基因分别显着差异上调和下调 [图 3（a）]。此外，在 DCM 和 ICM 的差异表达基因中，共有136个共有基因被鉴定为上调，其中92个为下调（图3（b））。这些基因与 DCM 和 ICM 引起的 HF 常见变化有关（见补充材料 2）。

为了揭示 HF 中涉及的分子机制，作者使用 Metascape 对髓系细胞中常见的 DEG 进行了功能富集分析。分析显示，136个上调基因显著富集于炎症反应相关通路，如白细胞活化、淋巴细胞活化调节、免疫应答正调控、免疫效应反应调节、免疫效应过程、细胞因子产生的正调控、淋巴细胞和非淋巴细胞之间的免疫调节相互作用以及细胞因子介导的信号通路（图3（c））。相比之下，92个下调基因在损伤修复相关途径中显示出显着的富集，例如受体介导的内吞作用，对损伤的反应，DNA损伤/端粒应激诱导的衰老和血管形态发生[图3（d）]。

在髓系细胞相互作用中的信号通路和关键因子的作用

为了预测髓系细胞和其他细胞之间的细胞间相互作用，作者根据配体的表达水平和相互作用与它们各自的受体将这些细胞群联系起来。使用 Cellchat R 包来推断细胞特异性信号传输，并为三组（正常、DCM 和 ICM）创建 Cellchat 对象，以识别每组中的重要信号。信号整合分析得出了 58 条具有显著相互作用的通路 [图 4（a）]。使用髓系细胞作为信号发送者，发现三种基于 CXCL 的相互作用 CXCL8-ACKR1、CXCL3-ACKR1 和 CXCL2-ACKR1在ICM中增强了髓系和EC之间的通信[图4（b）]。

在DCM和ICM中，以髓系细胞为接收器的信号显着增强，包括MIF，IL16，MHC-II，CXCL和CD99（图4（c））。发现 MIF 信号被识别为信号的接收器或发送者。

此外，观察到免疫细胞和骨髓细胞在MHC-II（HLA-DR、HLA-DP、HLA-DO、HLA-DQ和HLA-DM）和CD4之间的相互作用方面存在显着差异。骨髓细胞通过 CXCR4 和 CXCL12 与基质细胞（EC、SMC 和成纤维细胞）相互作用。LGALS9-CD45/CD44 对的相互作用在 ICM 和 DCM 中得到加强，但在对照中则没有。

作者将 DCM 和 ICM 患者髓样细胞中的偶联基因与 CellChat 鉴定的受体配体相交，发现 CXCR4、CD74、HLA-F、IFNGR1 和 KLRB1 这五个分子显着上调（图 4（d））。在这些分子中，CD74 和 CXCR4 协同作用形成 MIF 受体复合物。上述信号通路（MIF）的相互作用网络，如 图4（e） 所示，表明所有其他细胞，尤其是T细胞，都可以通过MIF-CXCR4+CD74分子与髓样细胞相互作用。

CXCR4 和 CD74 诊断性能的评估

为了研究MIF信号转导对HF进展的调节作用，作者对 CXCR4+CD74 对和MIF的基因进行GO的BP分析。结果表明，MIF信号分子主要参与趋化性的调控，并受NF-κB1和RELA的调控（补充3）。scRNA-seq数据表明，源自DCM和ICM的髓样细胞CXCR4和CD74的表达水平显著升高[图5（a）]。此外，在包含 DCM、ICM 和正常样本的bulk数据集中验证了这一结果。与正常组相比，作者观察到 DCM 和 ICM 中 CXCR4 和 CD74 的一致上调，而 ICM 和 DCM 之间没有检测到显著差异 [图 5（b）– 5（d））。

为了评估 CD74 和 CXCR4 作为 HF 预测生物标志物的值，作者构建了 ROC 曲线并计算了 AUC 值（图 5（e）– 5（g））。CD74和CXCR4的AUC分别为0.739和0.702（GSE5406）图5（e） ；0.743和0.715 （GSE57338）（图5（f））和0.864和0.786 （GSE79962）（图5（g））。此外，也比较了心衰诊断的常见生物标志物，包括NPPB、LGALS3、ST2和GDF15。结果表明，与这些常见的生物标志物相比，CD74 和 CXCR4 具有更高的 AUC 值，表明 CD74 和 CXCR4 对 HF 疾病具有潜在的诊断价值。

骨髓细胞亚群的单细胞分析

在心衰患者中观察到的主要免疫细胞群是髓系细胞，尤其是巨噬细胞。先前的研究表明，巨噬细胞具有不同的亚群，它们响应免疫环境的变化而执行专门的功能。为了更深入地了解健康个体和HF患者中不同巨噬细胞亚群的异质性，作者研究了髓样细胞的转录变化和异质性。使用UMAP分析将髓系细胞分为12个亚组（图6（a）），发现DCM / ICM的髓系细胞与正常样本不同（图6（b））。

此外，评估了不同细胞亚群中 CXCR4 和 CD74 的表达，发现 CD74 在所有细胞亚型中均高表达，而 CXCR4 在所有髓系亚群中均高表达，但 Mφ3、循环 Mφ 和 CD14 + 单1细胞除外[图 6（c）]。为了确定基因表达变化与细胞内信号传导之间的关联，作者使用 Dorothea 评估了髓样细胞亚簇中的 TF 活性。结果表明，循环Mφ的TF活性最高，其次是Mφ2和Mφ1（图6（d））。特别是，TFs NFKB1 和 RELA 在 Mφ2 和 Mφ1 中被激活 （图 6（e）– 6（f））。

为了说明细胞亚型的变化，计算了每组细胞亚型的相对比例，正常样本中髓系细胞的主要亚型是Mφ1和Mφ3（图6（g））。另一方面，在DCM和ICM中，Mφ2和Mφ4、树突状细胞和单核细胞（CD14 + mono2、CD16 + mono2）的百分比显著增加，而Mφ3的比例下降（图6（g））。在取样组织来源方面，DCM 和 ICM 患者血液中 CD16 + 单核细胞的比例显着增加，而 DCM 左心室和 ICM 梗死区域的 Mφ2 比例显着升高 [图 6（h）]。

髓样细胞亚簇的功能分析

为了研究每个髓样细胞亚簇的功能，作者对每个亚簇进行了差异基因表达分析（图7（a））。火山图显示，Mφ2 对炎症趋化因子（CXCL2、CXCL3 和 CXCL8）和相关基因（CCL3、CCL4、CCL3L3 和 CCL4L2）表现出高水平的表达 （图 7（a））。促炎评分还显示，Mφ2是主要的促炎簇[图7（b）]。抗炎评分还显示，Mφ3是相对抗炎的簇[图7（c）]。对 Mφ2 中上调基因的 GO 分析显示粒细胞趋化性和迁移以及抗原加工和呈递的富集（补充材料 1）。KEGG富集分析显示，炎症通路富集于Mφ2亚群，如NF-κB、IL-17和TNF信号通路（补充图S3B）。GSEA进一步揭示了与Mφ2中炎症和细胞趋化性调节相关的几种生物学途径的富集[图7（d）]。另一方面，Mφ3 显示出 LYVE1 的高水平表达，LYVE1 被认为是组织驻留巨噬细胞的标志物 [图 7（a）]。GO和KEGG富集分析显示Mφ3与内吞作用相关（补充材料 1）。GSEA还揭示了Mφ3中与炎症和内吞作用调节相关的几种生物途径的富集[图7（e）]。

髓系细胞亚群的分化轨迹

最后，进行了伪时间分析，以推断骨髓细胞亚群的分化轨迹，更好地了解它们的转变。使用Monocle3，构建了一个发育轨迹，并将其叠加到Seurat定义的轨迹集群上（图8（a））。细胞群在Monocle3中重新分布，正常组的细胞群与HF组的细胞群使用刻面图清晰分离（补充材料 1）。观察到 Mφ3 与单核细胞明显分离。此外，一些部分与Mφ1在同一分支中被发现（图S4B）。考虑到组织驻留标记物 （LYVE1） 的高表达，Mφ3 可能是非来源于单核细胞的驻留样亚群。尽管 Mφ1 分为两条轨迹，但除了与 Mφ3 重叠的部分轨迹外，其其余轨迹与 Mφ4 和 TREM2 + 巨噬细胞密切相关（图 8（a） 和补充 1）。Mφ2与促炎反应有关，显示出与单核细胞最短的分支距离，因此可能起源于单核细胞分化（图8（a）和补充1）。

为了研究单核细胞和巨噬细胞在分化行为方面的关系，使用 Monocle2 分析了 DCM 和 ICM 组中的四个巨噬细胞亚群和 CD14 + 单核细胞。在DCM组中，伪时间轨迹显示CD14 + 单核细胞是起点，其次是Mφ2和Mφ1，然后是Mφ4或TREM2 + Mφ（图8（c））。在ICM组中观察到类似的巨噬细胞转化轨迹[图8（e）]。炎症因子的表达呈明显增加趋势，随后在巨噬细胞分化过程中下调[图8（f）]。