空间转录组揭示玉米胚乳发育过程中细胞异质性的研究

这篇文章是2023年11月8日发表在Nature Communications上一篇文章，主要讲的是利用单细胞空间组学的方式对玉米胚乳发育过程中细胞异质性的研究[1]。

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文章链接：https://doi.org/10.1038/s41467-023-43006-7

研究团队是上海植生所的巫永睿教授

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摘要

玉米籽粒是由母体组织、胚胎和胚乳组成的复杂生物系统。缺乏具有空间信息的基因表达谱限制了对每个细胞群体特定功能的理解，并阻碍了对籽粒中优良基因的探索。在作者的研究中，作者对玉米籽粒的灌浆阶段进行了显微切片和空间转录组学分析。这使作者能够通过电子RNA原位杂交可视化所有基因的表达模式，并鉴定了11个细胞群体和332个分子标记基因。此外，作者系统地阐明了玉米籽粒中三种主要物质（淀粉、蛋白质和油）的空间储存机制。这些发现为控制玉米籽粒农艺性状的功能基因提供了宝贵的见解。

研究背景

玉米作物具有重要的经济和营养价值。玉米籽粒的发育过程可以分为以下阶段：双受精和细胞分裂分化阶段（1~10 DAP）、储存物质积累阶段（10~35 DAP）、成熟阶段（35~56 DAP）。胚乳在玉米籽粒发育中起着重要的作用。在发育的早期阶段中，受精的胚珠经历快速的细胞分裂和分化，但尚未发生大量的储存物质积累。在10天后，细胞命运主要由细胞分化的停止决定，籽粒开始积累淀粉颗粒、蛋白质和油脂等储存物质。胚乳成为主要的淀粉和蛋白质积累器官，而胚则起到油脂储存的作用。

了解调控储存物质积累的细胞群体的功能需要了解基因如何与空间环境相互作用。为了解析这种相互之间研究情况，目前是通过重测序技术对其中的信号转导通路进行了解析。但是空间互作信息还是比较少的，显微切割技术是一种用于研究空间结构的方法。该技术通过使用激光切割技术，将玉米种子中不同的组织区域进行分离，并进行RNA测序分析，以研究这些区域的基因表达差异。这项研究发现了与胚乳细胞分化相关的调控模块，并确定了与胚乳细胞分化相关的转录因子。这项研究的结果对于理解玉米胚胎发育的分子机制具有重要意义。

而这篇研究运用的空间转录组技术是一种高通量的基因表达分析方法，可以同时检测组织中数万个基因的表达水平，并将这些基因的表达信息与其在组织中的空间位置相对应。该技术通过将组织切片、固定、测序和分析，可以揭示基因在组织中的空间分布和表达模式，从而帮助研究人员理解细胞类型和组织结构之间的关系，以及基因在发育和疾病过程中的功能。

因此这篇文章是关于玉米胚乳发育过程中细胞异质性的研究。研究使用了空间转录组学技术，通过对玉米内部不同组织的转录组进行测序和定位，揭示了玉米胚乳发育过程中细胞的空间分布和基因表达模式。研究发现了玉米胚乳中不同细胞类型的特征基因，并构建了基因共表达网络。此外，研究还开发了一个在线工具，用于直观展示基因的空间表达模式，以促进基因注释和挖掘。

结果

Kernel size and cell expansion during maize endosperm development

作者选用W64A玉米自交系进行空间转录组学研究，是因为它被广泛用于研究玉米籽粒灌浆和胚乳质地相关的基因功能，为了研究整个胚乳的发育周期，作者对10-24 DAP的玉米籽粒进行半薄切片观察，发现可以基本确定外种皮、胚乳鞘层（endosperm-AL）、胚乳、基底胚乳转运层（endosperm-BETL）等部分，并对上述时期的玉米籽粒进行了空间转录组切片。

Spatial transcriptomes reveal kernel heterogeneity and functional compartments at filling stages

作者对12, 18, 和 24 DAP的玉米籽粒进行取样，包埋固定及切片染色后，在10x Genomics Visium上进行空间转录组学建库及数据分析，确定了25个细胞亚群（发现研究定位到的结果与之前的显微切割数据的重复性较好，表明结果的准确性）。

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通过显微切割数据及marker gene与原位杂交试验的验证，25个亚群最终注释为11个人工注释亚群。

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空间转录组的好处是可以模拟RNA原位杂交技术对多个玉米的基因进行原位杂交确定其表达部位。作者也发现了多个在不同组织中表达的特异高表达基因。为了对这些基因的情况进行探究，作者选用了高表达高variability的2986个基因进行WGCNA网络构建，分析得到的每个moudle都对应着人工注释亚群获得的11个亚群结果，在GO注释结果上也得到了很好的验证内容。这些moudle内容也对应着整体发育的三个时间段，从受精开始到籽粒灌浆的过程，这些胚乳细胞的亚群结果与其他母体组织的发育过程具有较近的分支关系，同时具有很强的相关性，表明尽管母体和子代组织在遗传起源上存在差异，但它们的基因表达程序是协同工作的。

Mining key genes essential for sucrose transport and storage accumulation

通过对上面的11个亚群进行特异高表达基因鉴定，获得了2992个差异基因，并对这些基因进行GO富集分析，发现胚乳-SE、胚乳-VE和胚乳-SCU分别显示出碳水化合物合成过程、营养库活性和脂肪酸代谢过程。

其中有部分差异基因在WGCNA的网络中存在，对这些基因进行了空间转录组的原位观察和RNA原位杂交的试验验证，发现这些基因在胚乳部位都是高表达的基因。

其中作者发现了多个转录因子对胚乳的发育是至关重要的，如bHLH, MYB, and GRAS families。

Spatially differential distribution of storage metabolite synthesis-related transcripts in maize seeds

Vitreous endosperm（玻璃质胚乳）是玉米种子中的一个特定区域。它是空间转录组学研究中确定的几个胚乳区域之一。玻璃质胚乳以其半透明的外观为特征，用于储存发育中的胚胎所需的营养物质。在种子成熟时，这些成分的凝聚导致外部区域形成玻璃状胚乳，而内部区域形成软质淀粉胚乳。

作者发现有一些编码淀粉合成酶的基因可以作为endosperm-SE的marker基因。

而大部分与油及脂质合成的基因在胚胎部位表达。以上高表达基因的结果与玉米种子中油和脂质的空间特异性积累一致。

Functional validation of sucrose transporter genes

一般认为在谷粒充实过程中，蔗糖从源组织运输到汇组织。在韧皮部区域卸载后，蔗糖要么通过细胞壁转化酶被分解成果糖和葡萄糖，然后被单糖转运蛋白摄取，要么直接被蔗糖转运蛋白（SUTs）在谷粒的通道中转运，以进行营养输送。之前对SUT关于转运的报道有很多，然而，由于对其空间表达和定位的了解不足，因此尚不清楚SUT在细胞外液相转运过程中的确切作用。

作者发现在玉米基因组有7个与蔗糖转运相关的蛋白，qRT-PCR显示这7个蛋白在均在不同发育时期的玉米籽粒中有表达，作者的空间转录组数据显示，只有ZmSUT1和ZmSUT7在BETL中特异性表达，这表明这两个基因在空间调控中是保守的，而ZmSUT2、ZmSUT4和ZmSUT5在玉米种子中没有特定的空间模式。

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为了验证ZmSUT1和ZmSUT7在谷物灌浆过程中的功能，作者通过RNA干扰（RNAi）特异性抑制ZmSUT1和ZmSUT7的表达，使用BETL特异性基因（Betl9）启动子，并获得了两个独立的RNAi转基因系。作者发现，zmsut1/7RNAi种子的BETL区域的细胞壁内生长（CWI）明显受到抑制，表明ZmSUT1和ZmSUT7对CWI的形成至关重要。

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为了排除zmsut1/7RNAi对植物生长的可能影响，从而影响种子发育和谷物灌浆，作者使用zmsut1/7RNAi花粉授粉野生型穗，发现所得后代种子的大小和重量也显著减少，证实ZmSUT1和ZmSUT7对玉米谷物充实至关重要。因此，在BETL区域发生的ZmSUT1/7基因突变不仅影响该特定区域的表型，还会导致谷物整体表型问题，主要是由于营养物质运输受到干扰。

总结

作者描述了他们使用空间转录组学技术对玉米胚乳发育过程中的细胞异质性和功能区进行了研究。他们通过对12、18和24 DAP的样品进行空间转录组测序，鉴定了25个空间聚类，并将它们进一步合并为11个细胞群体。这些细胞群体包括两个母体来源区域（胚珠和外种皮）、两个胚区域（胚乳鞘和胚乳分生组织）以及七个胚乳区域（基底胚乳转运层、导管区、靠近胚乳鞘的胚乳、淀粉胚乳、玻璃状胚乳、外种皮和胚周围区域）。研究人员还通过验证标记基因的存在来验证这些新的细胞类型，并整合了解剖学信息，进一步揭示了这些细胞群体的功能。他们还开发了一个网站，可以直接可视化全基因组的电子RNA原位杂交图谱，以促进基因注释和优质基因挖掘。

可以发现通过空间转录学确定了更多的基因内容，下面详细介绍一下什么是空间转录组学。

传统的转录组只能将一块组织的信息解析清楚，而以前我经常解析的单细胞转录组是将整个组织进行悬液制备，而进行后续的单细胞的标记，这时丢失了空间信息，而空间组学是将样本进行了固定，可以明确样本中不同细胞组织的位置，而单细胞空间转录组学是提供一个3D的信号维度，将所有的组织进行固定，为每一个位置的细胞进行单细胞的标记，为后续的亚群降维提供了较好的细胞类型确定，解析了更多的信息，在分辨率的层次上更加精细。

在植物上也有很多的应用。例如2022年华大基因开发的stere-seq方法，对拟南芥的叶片进行固定，成功区分了上表皮细胞和下表皮细胞之间微小但显著的转录组差异[2]。这些研究基础为后续在更多的植物上应用单细胞空间转录组学奠定了基础，可以解析更多微小的差异基因，提高对研究内容的了解。

参考文献

1. Fu Y, Xiao W, Tian L, Guo L, Ma G, Ji C, Huang Y, Wang H, Wu X, Yang T, et al: Spatial transcriptomics uncover sucrose post-phloem transport during maize kernel development. Nature Communications 2023, 14.

2. Xia K, Sun HX, Li J, Li J, Zhao Y, Chen L, Qin C, Chen R, Chen Z, Liu G, et al: The single-cell stereo-seq reveals region-specific cell subtypes and transcriptome profiling in Arabidopsis leaves. Dev Cell 2022, 57:1299-1310.e1294.