单细胞数据揭示两种巨噬细胞亚型及其预测胃腺癌免疫治疗和预后的相关预后因素

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基本信息

文章标题：Single-cell data revealed CD14-type and FCGR3A-type macrophages and relevant prognostic factors for predicting immunotherapy and prognosis in stomach adenocarcinoma 发表时间：2024-01-22 发表杂志：PeerJ 在线阅读链接： https://peerj.com/articles/16776/

文章摘要

背景：胃腺癌 （STAD） 表现出严重的肿瘤异质性，这带来了巨大的治疗挑战。单细胞测序技术是鉴定特征细胞类型的有力工具。

方法：本研究纳入了单细胞测序数据（scRNA-seq）GSE167297 和来自 TCGA、GTEx、GSE26901 和 GSE15459 数据库和数据集的bulk RNA-seq数据。通过降维和注释 scRNA-seq 数据，使用 AUCell 评分识别鉴定了肿瘤进展中的关键细胞类型。然后通过加权基因共表达网络分析（WGCNA）鉴定相关基因模块。通过 LASSO COX 模型识别 STAD 中的预后因素，构建预后评分系统。此外，通过TIMER、ESTIMATE 和 TIDE 分析评估了 RiskScore 组患者对免疫治疗的反馈。最后，验证预后因素在胃癌细胞系（MKN7 和 MKN28）和人正常胃黏膜上皮细胞（GES-1）中的表达水平，并通过 CCK8 实验和细胞周期来检测预后因素对胃癌细胞活性的影响。

结果：scRNA-seq分析显示，共鉴定出11种细胞类型，巨噬细胞的AUCell评分相对较高，有特异性表达CD14和FCGR3A基因。高巨噬细胞评分使 STAD 患者的预后恶化。将WGCNA分析中获得的巨噬细胞亚群（670）和巨噬细胞模块基因（2,360）中特异性表达的基因取交集，在86个常见基因中，鉴定出7个预后因子（RGS2、GNAI2、ANXA5、MARCKS、CD36、NRP1和PDE4A），并组成了 RiskScore 模型。低风险组患者表现出更好的生存优势。列线图还为 STAD 患者 1 年、3 年和 5 年的生存率提供了有利的预测。此外，发现低风险评分患者对免疫治疗的正反馈。MKN7 和 MKN28（两种胃癌细胞系）中 7 个预后因子的表达趋势与 RNA-seq 数据中的表达趋势一致，也比较了公共 HPA（人类蛋白质图谱）数据库中的蛋白质表达水平。进一步的功能探索表明，MARCKS是调控STAD细胞活力的重要预后因素。

结论：本研究初步揭示了STAD患者的单细胞图谱，巨噬细胞相关基因特征和列线图显示出良好的免疫治疗和预后预测能力。总的来说，该工作为LUAD患者的分子机制和治疗方法提供了新的见解。

疾病背景和实验设计

疾病背景

胃腺癌 （STAD） 每年威胁至少 100 万人的生命和健康，是世界上一个紧迫的公共卫生问题。一些地区的不良生活习惯，如高油和高盐、病毒感染或吸烟和酗酒是 STAD 的主要致病因素。到目前为止，内窥镜检查被认为是最好的早期筛查方法，并且已将 STAD 患者的生存优势提高了至少 30%。然而，缺乏对早期筛查、现有恶性转移和治疗耐药性的认识，STAD 仍然是最致命的恶性肿瘤，5 年生存率低于 20%。因此，对STAD的预后和治疗性生物标志物进行创新挖掘是当务之急。

到目前，研究人员建立了与氧化应激和代谢相关、记忆 B 细胞校正的 miRNA 、补体系统相关以及与铁死亡相关的基因特征模型，希望预测患者可能面临的潜在风险，并帮助医生制定更个性化的治疗计划， 提高患者的治疗效果和生存率。然而，STAD 的异质性对治疗来说是一个巨大的挑战，深入了解所涉及的机制是克服 STAD 治疗耐受性的关键。

新兴的单细胞测序技术（scRNA-seq）对单个细胞进行测序，以精确获得细胞中的遗传特征和克隆多样性，从而可以通过细胞聚类来区分肿瘤异质性。例如，通过scRNA seq方法发现了LUAD和鳞状癌之间的异质性免疫景观，表明这两种肺癌可以采用不同的免疫治疗方法。在具有 EGFR 突变的 LUAD 患者中，早期的异质性肿瘤和免疫细胞群也被发现是一种很有前途的 LUAD 诊断方法。Shen， Chen & Gao 构建了一个间充质干细胞相关模型，用于通过 scRNA-seq 方法评估 STAD 患者的预后和药物敏感性。同样，通过将scRNA-seq与批量数据相结合，肿瘤浸润B细胞上的CXCR4显示出较差的生存结果，并被认为是STAD的治疗靶点。 然而，基于scRNA-seq方法的巨噬细胞在LUAD中的相关研究很少见，仅发表了一项STAD卵巢转移中的M2巨噬细胞相关预后和免疫治疗特征。因此，准确鉴定巨噬细胞类型并深入探索其在STAD中的作用是有意义的。

实验设计

scRNA-seq：GSE167297数据集，14个样本，包括癌症样本和正常样本（surgically dissected superficial and deep layers of five diffuse-type gastric cancers along with matched normal）

bulk RNA-seq 训练集：TCGA_GTEx-STAD（训练集）的349个肿瘤样本和391个正常样本

bulk RNA-seq 验证集：GSE26901和GSE15459数据集的109个和182个肿瘤样本

结果

STAD中的细胞类型

经过筛选和处理，本研究纳入了来自GSE167297的 14 个样本中 22,258 个细胞的测序数据。在注释之前消除了样品之间的批次效应，在分辨率为0.8时被清楚地分为26个细胞簇（图1A）。根据标记基因表达特征，将26个细胞簇定义为11种细胞类型（图1B和表2）。在11种细胞类型中特异性表达的标记基因以不同的可视化形式显示（图1C，S2和S3）。

图1D和1E说明了样品中B细胞、T细胞和巨噬细胞类型的比例以及细胞在簇中的分布，其中巨噬细胞的比例较小。巨噬细胞显示出较高的AUCell评分，表明巨噬细胞的细胞活性较高（图1F和1G）。这些结果表明，尽管巨噬细胞的百分比较低，但对 STAD 的影响更大。

巨噬细胞相关基因模块

基于STAD患者在TIMER中获得的6种免疫细胞（B细胞、T细胞CD4+、T细胞CD8+、中性粒细胞、巨噬细胞、髓样树突状细胞）的免疫评分，根据中位数分为高低免疫评分组。结果发现仅在巨噬细胞组中表现出生存差异（图2A）。巨噬细胞影响STAD患者的生存，单细胞数据中也显示出更高的巨噬细胞活性，因此巨噬细胞可能是调节STAD预后的关键因素。此外，通过WGCNA鉴定了与巨噬细胞高度相关的基因模块。当软阈值 β = 8 且相关系数 = 0.85 时，该网络具有生物学意义（图 2B），最终鉴定出6个基因模块（图2C和2D）。

以年龄、性别、T期、N期、M期、分期、分级、巨噬细胞为表型，对6个基因模块进行Pearson相关性分析。粉红色模块与巨噬细胞之间存在显着的正相关（r = 0.69，p < 1e−5），因此，将粉红色定义为巨噬细胞相关基因模块（图2E）。粉色模块内基因的通路富集分析表明，这些基因主要富集于癌症通路、PI3K-Akt信号通路、癌症蛋白聚糖、多细胞生物过程调控和定位调控。这些基因在信号转导受体结合和细胞外基质结构组成中具有分子功能，并参与细胞外区域部分和细胞外空间等细胞成分（图2F）。结果表明，粉红模块内的基因主动调控STAD的细胞间通讯交换。

用于预测 STAD 预后的 RiskScore

在单细胞分析中，巨噬细胞类型与其他细胞相比，有 670 个标记基因的表达显著差异。将这些差异基因与粉红色模块基因中的86个交集基因用以构建 LASSO COX 模型（图 3A）。在 5 倍交叉验证下，观察到该模型在 λ = 0.0389 时最优（图 3B 和 3C）。RGS2、GNAI2、ANXA5、MARCKS、CD36、NRP1和PDE4A是STAD的预后指标，其中GNAI2和PDE4A是保护指标，RGS2、ANXA5、MARCKS、CD36和NRP1是危险指标（图 3D）。

根据训练集（TCGA_GTEx-STAD）和验证集（GSE26901，GSE15459）中的K-M生存分析和ROC曲线判断RiskScore的预后评估价值。结果发现3个数据集1年的AUC值分别为0.68、0.67和0.72。3个数据集3年AUC值分别为0.70、0.71和0.71。两个验证集的 5 年 AUC 值分别为 0.71 和 0.68。简而言之，在所有三个数据集中，所有 AUC 值都高于 0.6（图 3E、3G 和 3I）。此外，低 RiskScore 在所有三个数据集中都显示出预后优势（图 3F、3H 和 3J）。因此，RiskScore是一个值得信赖的预后系统。

预后因素的表达图谱和突变图谱

分析RiskScore系统中预后因子和蛋白质产物的表达水平。首先，在HPA数据库中查询RGS2、GNAI2、ANXA5、MARCKS、CD36、NRP1和PDE4A的蛋白产物表达水平。MARCKS基因编码的蛋白质在STAD组织中的表达低于正常胃组织（图4A）。STAD组织中RGS2、PDE4A和CD36的mRNA水平升高，正常组织中GNAI2、MARCKS和NRP1的mRNA水平升高（图4B）。7个预后因素的表达也具有组织特异性。RGS2在胞质溶胶中特异性表达，ANXA5在核膜中特异性表达，CD36在高尔基体中特异性表达（图4C）。此外，发现 GNAI2 的显着拷贝数缺失（图 4D）。

基于 RiskScore、分期和年龄组成的列线图

RiskScore组中具有不同临床因素的患者比例，T期和分级亚组患者之间存在显着差异（图5A）。随着临床因素的增加，患者的风险评分也呈现出增加的趋势（图5B）。

基于临床因素和RiskScore的单因素和多因素COX分析显示，RiskScore、分期和年龄是STAD的独立预后因素，并且都是危险因素（风险比>1，p<0.05）（图5C和5D）。因此，根据 RiskScore、分期和年龄，作者绘制了用于预测 STAD 患者 1 年、3 年和 5 年生存率的列线图（图 5E）。

校准曲线显示预测曲线与实际观测的1年、3年和5年生存曲线拟合良好；因此，列线图是STAD的可靠预后预测工具（图5F）。决策曲线也进一步证实了列线图和RiskScore的强稳健性，两者都比极端曲线具有更好的表现（图5G）。与其他临床因素的预后价值相比，列线图和RiskScore的AUC值显著优越，显示出较强的预后预测价值（图5H）。

在RiskScore组中差异的生物学途径和免疫图谱

本研究还讨论了 RiskScore 组中 DEGs 调控的生物学途径。在高风险评分组中发现了 506 个上调的 DEG（图 6A），而下调的 DEG 数量很少，因此选择了 Over-Representation analysis(ORA)。ORA结果显示，上调的DEGs主要参与血管形态、细胞外基质成分和糖胺聚糖结合的形成过程（图6B）。

在 ssGSEA 中鉴定出 RiskScore 亚组中存在 50 个 HALLMARK 通路，作者评估了它们与 RiskScore 之间的 Spearman 相关性（图 6C）。GSEA结果显示，高风险组启用了HALLMARK_TNFA_SIGNALING_VIA_NFKB、HALLMARK_HYPOXIA、HALLMARK_IL6_JAK_STAT3_SIGNALING、HALLMARK_APOPTOSIS、HALLMARK_APOPTOSIS和HALLMARK_ANDROGEN_RESPONSE、HALLMARK_MYOGENESIS、HALLMARK_INTERFERON_GAMMA_RESPONSE、HALLMARK_APICAL_JUNCTION、HALLMARK_COMPLEMENT HALLMARK_EPITHELEMENT HALLMARK_EPITHELIAL_MESENCHYMAL_TRANSITION（图6D）。

此外，作者还评估了RiskScore亚组患者的免疫状况。在高风险评分组中，ImmuneScore、StromalScore较高，T细胞CD8+、巨噬细胞、髓样树突状细胞评分较高（图6E和6F）。RiskScore与TIDE评分呈正相关，表明高危人群更容易发生免疫逃逸，更不容易从免疫治疗中获益（图6G）。

RiskScore模型信度的实验验证

为了验证 RiskScore 模型，作者使用 qRT-PCR 检查了 MKN7、MKN28 和 GES1 细胞系中 RGS2、RNAI2、ANXA5、MARCKS、PDE4A、CD36 和 NRP1 的表达（图 7A-7G（略））。qRT-PCR结果与RNA-seq数据分析中的表达水平相匹配。WB检测MARCKS的表达，MARCKS对RiskScore模型的贡献最大。结果显示，胃癌细胞系MKN7和MKN28中MARCKS表达升高（图7H（略））。在MKN7和MKN28中抑制MARCKS后，通过细胞周期（图7I和7J（略））和CCK8测定（图7K和7L（略））观察到MKN7和MKN28细胞中的细胞活性降低。