scDNAseq 拷贝数变异分析肿瘤克隆进化

研究背景

HCC 约占肝癌的 80%，因存在肿瘤异质性 ITH 而导致疗效有限，目前还缺乏单细胞层面的 HCC 肿瘤异质性图谱。而基因组不稳定引起的拷贝数改变 (CNA) 是 ITH 的主要来源。

研究方法

• 病人或样本：10个 HCC 患者分离的 1275 个细胞进行 scDNAseq， 1 个患者的 356 个细胞进行倍性 scDNA-seq，3名患者的27344个细胞进行scRNA-seq
• scDNA-seq 主要是采用了 MALBAC 方法进行全基因组扩增，该方法覆盖率较高，适合 CNA 分析。Illumina HiSeq X Ten 平台（2 x 150 bp ）进行测序。原始数据处理和普通的 bulk 测序没有太大区别。

• CNV 分析是先将基因组分为 500kb 单位的bin，共6206个bin，过滤后剩下 6037个，用 Bedtools 进行 counts 计数，用非肿瘤细胞作为对照。然后用 DNAcopy R包的 CBS 算法进行 segment分析，使用 aCGH 包的 mergeLevels 进行segment 拼接。ComplexHeatmap 进行聚类和可视化。关心的癌基因主要来自：

研究结果

• scDNA-seq结果：1222个肿瘤细胞和53对照正常细胞进行的 scDNAseq，平均测序深度是 0.4x，分析得到的拷贝数变异结果：发现了 3 个肿瘤细胞亚群（图1B），不同患者的细胞亚群占比不一样（图1C）

• P9 患者：123个细胞，其中包括7个整倍体、27个伪整倍体和89个非整倍体细胞（图2A），CNA 的累积共享百分比显示，非整倍体细胞共享的 CNA 百分比比伪整倍体细胞高得多（图2B），作者认为这意味着克隆多样性在相对早期阶段很大，然后随着肿瘤进展而减少，表明潜在的克隆扩张。通过基于所有单细胞的 CNA 事件构建系统发育树来检查 CNA 异质性的进化（图 2 C）。值得注意的是，这棵树表现出较短的树干和高度多样化的分支，显示出随着细胞从整倍体基因组发展到非整倍体基因组，CNA 广泛且逐渐积累。
• 基于CNA counts 进行累积可视化时，发现不同病人都表现出了同一个规律，即出现短暂爆发性的CNA增长。这与 TNBC 报道的 PCNE 模型一致。

• 但是基于 adjusted R2, predicted R2, Bayesian information criterion, and Akaike information criterion 这四个指标进一步拟合模型，作者发现 DPCNE 模型更加符合这 10 名患者的 CNV 进行模式（图3A），然后计算 pairwise distances of CNA profiles (PWD-CNA) 指标，基于中位数将10个患者分为 P-group 和 G-group。一些驱动 CNA 在 G 组中富集，例如ARID2的扩增和TSC1和WNK2的丢失（图3G）。基于G组的CNA相关基因集，进一步设计实验进行 bulk RNAseq 和TCGA-LIHC 数据挖掘，发现 CAD 基因扩增与较高的 ITH 和早期肿瘤复发相关。

• 随后进行 scRNAseq，3个患者的27344个细胞，结果验证了前面的 DPCNE 模型。同时也发现，从 scRNA-seq 数据推断出的 CNA 结果比 scDNA-seq 中的 CNA 结果噪声更大，缺乏明确确定小 CNA 的能力

总结

作者分析发现，其拟合的模型 DPCNE 表明肝癌中的间断进化和渐进进化并不相互排斥，两种进化模式可以在同一肿瘤中共存，并可能在不同阶段驱动肝癌的发生。scDNA-seq 和 scRNA-seq 方法在检测 CNA 方面各有利弊。scDNA-seq可以准确测定CNA，使其成为研究复杂肿瘤亚克隆结构的标准工具，但是通量较低，仅限于数百个细胞。而scRNAseq 能够在一次测定中对数千个细胞进行高通量转录组分析，但是无法直接确定 CNA。研究发现，基因CAD ，作为 HCC 的新型预后生物标志物。