BD Rhapsody上游定量流程

生信菜鸟团

发布于 2024-04-11 15:05:35

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发布于 2024-04-11 15:05:35

工欲善其事必先利其器

单细胞技术的核心是能够从单一细胞获取高通量的基因表达数据。与传统的基因表达分析相比，它不是测量一个样本中成千上万细胞的平均表达，而是能够揭示个别细胞之间的差异，这对于理解组织中的微环境、细胞类型的多样性及其功能至关重要。而对于单细胞转录组学技术，除了大火的10X单细胞技术以外，另一个就是由 Becton, Dickinson and Company开发的BD Rhapsody 。BD Rhapsody 系统通过以下几个主要步骤来实现单细胞转录组分析：

细胞捕获和制备：首先，单个细胞被捕获并封装到微流控芯片的微孔中。每个微孔还包含了用于逆转录的全部所需试剂，允许在单细胞水平上进行mRNA的捕获和转录成cDNA。
标记和扩增：利用BD Rhapsody 的微球技术，每个微球都被标记有唯一的分子标记（UMI）和细胞标记，这使得在后续的步骤中可以追踪每个cDNA分子来源于哪个细胞。随后进行cDNA的扩增。
测序准备：扩增后的cDNA被制备成适合测序的文库，通过下一代测序（NGS）平台进行高通量测序。
数据分析：最后，生成的序列数据被用于定量分析每个细胞的基因表达水平，可以利用各种生物信息学工具和算法来识别细胞类型、细胞状态、细胞间相互作用以及基因表达的调控网络等。

那么今天就来学习一下 BD Rhapsody 的上游定量流程

1首先是准备分析环境

安装 cwltool

mamba create -n BD python=3.11.3
mamba activate BD
pip install cwlref-runner

##如果pip安装失败，可以选择国内镜像安装
pip install cwlref-runner -i https://pypi.douban.com/simple/

下载 BD官方pipeline 文件

BD Genomics Rhapsody Analysis pipeline 网址：https://bitbucket.org/CRSwDev/cwl/src/master/v2.0/

v2.0

需要注意的一点是运行 rhapsody_pipeline_2.0cwl 这个是需要服务器上有配置好Docker且你有Docker权限的。可以简单看一下代码，是有用到docker的

rhapsody_pipeline_2.0cwl

2其次是下载参考基因组文件

网址：http://bd-rhapsody-public.s3-website-us-east-1.amazonaws.com/Rhapsody-WTA/Pipeline-version2.x_WTA_references/

参考基因组文件

##humam
wget -c https://bd-rhapsody-public.s3.amazonaws.com/Rhapsody-WTA/Pipeline-version2.x_WTA_references/RhapRef_Human_WTA_2023-02.tar.gz

##mouse
wget -c https://bd-rhapsody-public.s3.amazonaws.com/Rhapsody-WTA/Pipeline-version2.x_WTA_references/RhapRef_Mouse_WTA_2023-02.tar.gz

3最小化使用

yml文件修改

BD Rhapsody 上游定量流程其实已经封装的很好，环境及所需文件准备好后只需简单修改pipeline_inputs_template_2.0.yml 即可

主要修改Reads 【指定输入文件】和 Reference_Archive 【指定参考基因组文件】这个两个部分（如图所示）

pipeline_inputs_template_2.0.yml

更多pipeline的可选参数的修改见：https://bd-rhapsody-bioinfo-docs.genomics.bd.com/setup/input/parameters.html

提交运行

对于单个样本

yml文件的输入文件格式要求：

## 单个样本
Reads:

 - class: File
   location: "/home/project/b_rawdata/download/JZsc603/JZsc603_S33_L002_R1_001.fastq.gz"

 - class: File
   location: "/home/project/b_rawdata/download/JZsc603/JZsc603_S33_L002_R2_001.fastq.gz"

## 单个样本多个文件

Reads:

 - class: File
   location: "/home/project/b_rawdata/download/JZsc501/JZsc501_S13_L001_R1_001.fastq.gz"
 - class: File
   location: "/home/project/b_rawdata/download/JZsc501/JZsc501_S39_L004_R1_001.fastq.gz"

 - class: File
   location: "/home/project/b_rawdata/download/JZsc501/JZsc501_S13_L001_R2_001.fastq.gz"
 - class: File
   location: "/home/project/b_rawdata/download/JZsc501/JZsc501_S39_L004_R2_001.fastq.gz"

运行脚本run_BD.sh 写入以下内容

#! /bin/bash -xe

/home/username/miniconda3/envs/BD/bin/cwl-runner \ 
--outdir /home/project/test603 \
--tmpdir-prefix /home/project/sc603 \
/home/script/rhapsody_pipeline_2.0.cwl \
/home/script/test603.yml  #pipeline_inputs_template_2.0.yml修改后的文件

修改完 yml 文件提交后台运行即可

mmaba activate BD
nohup bash run_BD.sh 1>test501.log 2>&1 &

如果是多个样本

多样本的话，需要注意一下reads文件在yml文件的写法。

如果按以下方法给定输入文件：

Reads:

 - class: File
   location: "/home/project/b_rawdata/download/JZsc1641/JZsc1641_S3_L003_R1_001.fastq.gz"
   location: "/home/project/b_rawdata/download/JZsc1672/JZsc1672_S3_L004_R1_001.fastq.gz"
   location: "/home/project/b_rawdata/download/JZsc875/JZsc875_S18_L002_R1_001.fastq.gz"

 - class: File
   location: "/home/project/b_rawdata/download/JZsc1641/JZsc1641_S3_L003_R2_001.fastq.gz"
   location: "/home/project/b_rawdata/download/JZsc1672/JZsc1672_S3_L004_R2_001.fastq.gz"
   location: "/home/project/b_rawdata/download/JZsc875/JZsc875_S18_L002_R2_001.fastq.gz"

会报错 found duplicate key "location" 。

正确的写法应该是：

 - class: File
   location: "/home/project/b_rawdata/download/JZsc1641/JZsc1641_S3_L003_R1_001.fastq.gz"
 - class: File
   location: "/home/project/b_rawdata/download/JZsc1641/JZsc1641_S3_L003_R2_001.fastq.gz"
 - class: File
   location: "/home/project/b_rawdata/download/JZsc1672/JZsc1672_S3_L004_R1_001.fastq.gz"
 - class: File
   location: "/home/project/b_rawdata/download/JZsc1672/JZsc1672_S3_L004_R2_001.fastq.gz"
 - class: File
   location: "/home/project/b_rawdata/download/JZsc875/JZsc875_S18_L002_R1_001.fastq.gz"
 - class: File
   location: "/home/project/b_rawdata/download/JZsc875/JZsc875_S18_L002_R2_001.fastq.gz"

或者

 - class: File
   location: "/home/project/b_rawdata/download/JZsc1641/JZsc1641_S3_L003_R1_001.fastq.gz"
 - class: File
   location: "/home/project/b_rawdata/download/JZsc1672/JZsc1672_S3_L004_R1_001.fastq.gz"
 - class: File
   location: "/home/project/b_rawdata/download/JZsc875/JZsc875_S18_L002_R1_001.fastq.gz"

 - class: File
   location: "/home/project/b_rawdata/download/JZsc1641/JZsc1641_S3_L003_R2_001.fastq.gz"
 - class: File
   location: "/home/project/b_rawdata/download/JZsc1672/JZsc1672_S3_L004_R2_001.fastq.gz"
 - class: File
   location: "/home/project/b_rawdata/download/JZsc875/JZsc875_S18_L002_R2_001.fastq.gz"

多样本同时运行也仅需修改yml文件的输入即可，提交运行的命令同上

4结果文件

输出

通常结果包含以下文件（不同参数，会有些许出入）

[sample_name]_Metrics_Summary.csv : 测序、分子和细胞指标的报告，包含每个样品的测序质量、检测到的总分子数和细胞数等信息。

[sample_name]_Pipeline_Report.html ：测序分析运行结果的摘要报告

[sample_name]_RSEC_MolsPerCell_MEX.zip 和 [sample_name]_DBEC_MolsPerCell_MEX.zip: 基于RSEC或DBEC计算的每个细胞的生物产品(bioproduct)分子数量的数据表

[sample_name]_RSEC_MolsPerCell_Unfiltered_MEX.zip: 包含未经过滤的数据表，这些数据表列出了所有细胞标签以及有至少10次读数的细胞信息

[sample_name].BAM 和 [sample_name].BAM.bai: R2 reads的比对信息，默认参数为节省空间是不输出。

[sample_name]_Seurat.rds ：RSEC分子数据表和所有细胞注释元数据的Seurat（.rds）格式文件，用于R的Seurat包进行下游分析

[sample_name].h5mu或 [sample_name].h5ad: RSEC分子数据表和所有细胞注释元数据的Scanpy（.h5ad）/Muon（.h5mu）格式文件，用于Python的Scanpy包或其它兼容工具进行下游分析

[sample_name]_Bioproduct_Stats.csv ：基于RSEC和DBEC唯一分子标识符（UMI）调整算法的生物产品统计数据

注：(a) 如果是多重样本运行，数据表中包含了所有样本合并后的推测细胞数。(b) DBEC数据表只有在包括针对mRNA或AbSeq生物产品目标的实验时才有输出。

报告摘要-部分

通常来说，下游分析我们可以使用[sample_name]_Seurat.rds 这个文件走Seurat分析流程，但是由于目前rhapsody_pipeline_2.0cwl 这个pipeline封装的还是Seurat V4版本，所以该输出结果是Seurat V4的数据格式。

docker内的调用脚本

如果你想直接使用 SeuratV5 进行下游分析，其实也只需解压 [sample_name]_RSEC_MolsPerCell_MEX.zip 这个文件，正常读入文件即可进行后续分析。

关于MEX格式

MEX是单细胞技术中一种稀疏矩阵的表示方法。单细胞数据处理后通常以两种方式存储：HDF5格式或者MEX格式。

MEX是Market Exchange Format的缩写，通常包含以下几个文件来有效地存储和描述矩阵数据：

表达矩阵文件（matrix.mtx.gz）：这是最重要的文件，包含了基因表达数据。在稀疏格式下，它仅存储非零表达值及其在矩阵中的位置（即，哪个基因在哪个细胞中表达）。文件格式是.mtx，代表Matrix Market格式，这是一种广泛支持的标准稀疏矩阵格式。
基因标识符文件（features.tsv.gz）：通常是一个文本文件，列出了表达矩阵中每一行对应的基因。这个文件允许将表达矩阵中的行映射到实际的基因名称或ID。
样本或细胞标识符文件（barcodes.tsv.gz）：另一个文本文件，列出了表达矩阵中每一列对应的细胞。这使得研究者可以知道每一列数据对应的具体细胞样本。

MEX文件的特点是：