细胞鉴定曲线图理解

cellranger细胞鉴定曲线

一般得到10X Genomics的下机数据之后，我们需要使用Cellranger软件进行上游数据的处理，并且生成网页报告。

其中就包括了Barcode Rank Plot——细胞鉴定曲线图

细胞鉴定曲线图横坐标是Barcodes，纵坐标是UMI counts，都取log19.图中是将所有测序得到的Barcode按照其包含的UMI数进行降序排列，并且对细胞和非细胞标注不同的颜色，帮助区分。

然后基于细胞鉴定曲线图，设定一个cutoff值，决定去除掉哪些barcodes，并且保留下来部分Barcodes用于下游的数据分析。

下游数据读取及硬过滤标准

使用seurat来进行单细胞下游的数据分析，一般我们下载读取的数据都是经过上游cellranger流程处理过后的数据，保留下来几千到上万的barcodes来进行后续的数据分析。

但GSE139829这个数据就有所不同，它是提供了原始的矩阵信息，11个样品的数据量就高达一个G

如果使用简单的min.cells = 5,min.features = 500进行一个硬过滤，那就会去除掉绝大多数没有意义的Barcodes。不过我们也可以使用下游矩阵数据来复现一下cellranger的细胞鉴定曲线，找一下过滤的标准。

#读取数据创建seurat对象

counts = Read10X("outputs/UMM061/")

sce=CreateSeuratObject(counts = counts )

> dim(sce)
[1]  33694 737280

创建完seurat对象之后，在不进行任何操作时，seurat会为每个细胞创建一个元数据，保存在meta.data里面

每一列的内容：

• orig.ident：通常包含所知的样品名，默认为我们赋给project的值，如果不赋值那就是SeuratProject
• nCount_RNA：每个细胞的UMI数目
• nFeature_RNA：每个细胞所检测到的基因数目

那我们就可以使用nCount_RNA或者nFeature_RNA在R语言里面绘制细胞鉴定曲线，找到一个合适的cutoff值。

细胞鉴定曲线

cellranger是将所有测序得到的Barcode按照其包含的UMI数进行降序排列，并且对细胞和非细胞标注不同的颜色，帮助区分。那我们也按照对应的数据进行绘图。

a <- sort(log10(sce$nCount_RNA+1),decreasing = TRUE)

plot(a,
     xlab = "Barcodes",
     ylab = "nCount_RNA",
     xlim = c(100,100000)
)

从cellranger的3.0以后的版本，是把所有的barcodes按照UMI数进行排序后，取前1%的那个barcode所包含的UMI数量，记为m然后再去这个m的1/10作为cutoff值

那对应到我们的737280的数据，取1%就是7372，对应的UMI差不多是5000然后再取1/10，也就是500

如果使用nFeature_RNA同样的取log10之后作图，然后按照barcode包含的基因数进行排序，因为平均一个细胞的一个基因有10个左右的UMI，所以换算为基因的阈值就无需再取1/10，那根据取1%的barcode再对应到feature上差不多就是300-500左右的样子

log_data <- log10(sce$nFeature_RNA+1)

plot(sort(log_data,decreasing = TRUE),
     xlab = "Barcodes",
     ylab = "nFeature_RNA",
     xlim = c(100,100000))

基于细胞中至少要表达300个基因来对数据进行过滤

#基于min.features = 300进行过滤
sce2=CreateSeuratObject(counts = counts,
                        min.cells = 5,
                        min.features = 300)


> dim(sce2)
[1] 19222  9755

nFeature_RNA和nCount_RNA

一般很少会有下游是原始的rawcounts的数据，所以对于处理后的数据集我们可以可视化一下nFeature_RNA和nCount_RNA来辅助进行质控

那下期我们可以看看nFeature_RNA和nCount_RNA！