PDGFRα+ITGA11+成纤维细胞通过 ITGA11-SELE 相互作用促进早期癌症的淋巴血管侵袭和淋巴转移

分享是一种态度

题目：PDGFRa+ITGA11+ fibroblasts foster early-stage cancer lymphovascular invasion and lymphatic metastasis via ITGA11-SELE interplay 期刊：Cancer Cell 发表时间：2024 单位：中山大学孙逸仙纪念医院 组织类型：膀胱癌 bladder cancer (BCa) 组学：scRNA, ST 测序平台：10X Genomics 样本数：13个scRNA样本，包括4个癌旁，6个淋巴血管侵犯（LVI）positive，3个LVI negative 数据下载：GSE222315, GSE247629

背景知识

该论文探讨了在早期膀胱癌（BCa）中，癌相关成纤维细胞（CAFs）的异质性及其功能。通过使用scRNA和空间转录组学技术，发现了一种之前未知的表达PDGFRa+ITGA11+的CAFs亚群。通过对910例病例的多中心临床分析，证实这种PDGFRa+ITGA11+CAFs与早期BCa的淋巴血管侵犯（LVI）和预后不良有关。在敲除PDGFRa+ITGA11+CAFs的小鼠模型中，这些CAFs被证明可以促进LVI和淋巴结（LN）转移。从机制上来看，PDGFRa+ITGA11+CAFs通过识别淋巴内皮细胞上的ITGA11表面受体SELE来促进淋巴管生成，激活SRC-p-VEGFR3-MAPK信号通路。此外，PDGFRa+ITGA11+ CAFs的CHI3L1可以调整周围的基质，帮助癌细胞内窥镜入侵，进而促进早期BCa的LVI和LN转移。这项研究揭示了PDGFRa+ITGA11+ CAFs在形成转移性景观中的关键作用，并为早期BCa LVI的治疗提供了信息。

Figure 1 早期BCa伴LVI的scRNA分析

(A) BCa组织中LVI的代表性荧光图像。 (B) 不同临床队列中BCa的淋巴结转移和LVI百分比。SYSMH BCa队列中n = 318；STCH BCa队列中n = 68；GDPPH BCa队列中n = 44；ZJH BCa队列中n = 189；SMUTH BCa队列中n = 57；SYUTH BCa队列中n = 114；NFH BCa队列中n = 120。 (C) 多中心队列中不同T分期的BCa的LVI与LN转移的相关性。 (D) scRNA-seq的示意图。 (E) 细胞类型的UMAP图，并按主要细胞类型、组织和肿瘤着色。 (F) 热图显示每种主要细胞类型中markers。 (G 和 H) UMAP图和饼图显示BCa组织中有或没有LVI的不同细胞类型的数量。 (I–M) SYSMH的BCa组织中CAF浸润的代表性荧光图像及其量化（n = 318）。 (N 和 O) UMAP图和条形图显示BCa组织中有无LVI时成纤维细胞在scRNA-seq中的重新聚类。 (P) TCGA数据库的CAF群集浸润特征与BCa LVI的关系（n = 347）。

Figure 2 PDGFRa+ITGA11+CAFs 与早期BCa的LVI和LN转移相关

(A) 热图显示每个CAF亚群的关键基因。 (B) 热图显示从早期BCa组织中分离的CAFs中差异表达的蛋白质。 (C) 使用从早期BCa组织中分离的CAFs进行的qRT-PCR分析； (G 和 H) PDGFRa+ ITGA11+ CAFs在BCa组织中的代表性图像和定量（n = 390）。Imaris渲染带有PDGFRa（绿色）和ITGA11（红色）信号的细胞核 (I–K) SYSMH、STCH和GDPPH队列中PDGFRa+ ITGA11+ CAFs高或低浸润的BCa患者的Kaplan-Meier生存曲线（n = 180），或TCGA数据库（n = 347）。 (L) scRNA-seq中BCa组织中成对细胞类型的基因表达的Spearman相关性比例。红色：正相关；蓝色：负相关；灰色：不显著。 (M) SYSMH队列中BCa组织中PDGFRa+ ITGA11+ CAFs浸润、LYVE-1标记的MLD和CD31标记的血管密度的代表性荧光图像。 (N) PDGFRa+ ITGA11+ CAFs或PDGFRa+ ITGA11+-d CAFs共培养的HLECs的管型形成和迁移的代表性图像和定量。

Figure 3 在小鼠中敲除PDGFRa+ ITGA11+ CAFs抑制早期BCa的LVI和LN转移

(A) 生成PDGFRa-ITGA11D小鼠和BBN诱导的自发BCa模型的示意图。 (B) 从野生型和PDGFRa-ITGA11D小鼠中分离的PDGFRa+ CAFs中ITGA11表达的代表性荧光图像。 (C) PET-CT图像和饼图显示指定小鼠的转移性LN。 (D) 小鼠盆腔LN中荧光和HE染色的图像（n = 12）。 (E) 指定小鼠中转移性盆腔LN的定量（n = 12）。 (F) 肿瘤组织中PDGFRa+ ITGA11+ CAFs和MLD的代表性荧光图像及其定量（n = 12） (G) 指定小鼠的BCa组织中LVI的百分比（n = 12）。 (H 和 I) 分离CAF亚群并建立膀胱原位异种移植模型的工作流程。 (J) 代表性生物发光图像和饼图显示指定小鼠的转移性LN（n = 24）。 (K) 指定小鼠的原发BCa和转移性LN的代表性MRI图像（n = 24）。 (L) 指定组小鼠盆腔LN的代表性图像（n = 24）。 (M 和 N) 指定小鼠的主肿瘤组织中PDGFRa+ ITGA11+ CAFs、MLD和LVI的代表性荧光图像（n = 24）。

Figure 4 PDGFRa+ ITGA11+ CAFs上的ITGA11与HLECs上的SELE结合

(A) 空间转录组学中CAF亚群1和各亚群LEC的特征得分。 (B 和 C) CAF亚群1和BCa中LEC的特征得分的空间特征图和 Pearson相关性。 (D) 热图显示BCa中对应细胞类型的空间斑点数量。 (E) 代表性荧光图像及PDGFRa+ ITGA11+ CAFs与BCa中淋巴管之间距离的定量。 (F) 指定的带有GFP标记的CAF亚群在HLECs单层上的流式细胞术分析。 (G) 共聚焦图像显示GST标记的rITGA11与HLECs的质膜结合。 (H) 调查ITGA11在HLECs质膜上的结合蛋白的GST pull-down工作流程。 (I 和 J) 热图显示GST pull-down的定量蛋白质组学中潜在的ITGA11结合蛋白。 (K 和 L) GST pull-down试验或共免疫沉淀试验中ITGA11与SELE的结合。 (M) HLECs与指定的PDGFRa+ ITGA11+ CAFs共培养时，ITGA11与SELE在细胞表面的PLA信号。 (N) BCa组织中ITGA11与SELE的PLA信号。 (O) 共聚焦图像显示His标记的SELE与指定CAF亚群的ITGA11在质膜上的结合。 (P) 共聚焦图像显示GST标记的rITGA11与His标记的SELE在指定HEK-293T细胞的质膜上的结合。 (Q 和 R) 未标记rITGA11的逐渐增加浓度下，GST标记的rITGA11与His标记的SELE之间互动。 (S) BLI显示rITGA11与SELE的结合。彩色线条显示指定不同浓度的ITGA11的数据。 (T) 指定CAF亚群在有或无SELE刺激下迁移的代表性图像和定量。 (U) SELE刺激下迁移和未迁移CAF中ITGA11阳性CAF的代表性共聚焦图像和定量。 (V) GFP标记的PDGFRa+ ITGA11+ CAFs附着在预形成的类淋巴毛细血管结构上的代表性图像和定量。 (W) GFP的PDGFRa+ ITGA11+ CAFs附着在指定的HLECs形成的单层上。

Figure 5 ITGA11-SELE相互作用在HLECs中激活SRC/p-VEGFR3/MAPK信号通路

(A) BCa组织中ITGA11与SELE和MLD之间PLA的代表性图像（n = 40）。 (B) 指定HLECs中VE-cadherin表达的代表性荧光图像（上）。通过指定HLECs形成的内皮单层迁移的mCherry标记的RT4细胞的代表性图像和定量（下）。 (C) 在scRNA-seq中，作为供体细胞的PDGFRa+ ITGA11+ CAFs和作为受体细胞的HLECs的配体-靶基因调控潜力分析。 (D) scRNA-seq中LVI阳性BCa的LEC中显示信号传导途径的气泡图。 (E 和 F) 在有或没有敲低SELE的情况下，rITGA11刺激的HLECs中MAPK信号通路的分析。 (G 和 H) rITGA11刺激后SELE相互作用蛋白的Sliver staining和质谱分析。 (I 和 J) 在有或没有rITGA11刺激的HLECs中，SELE与SRC的相互作用的 Western blotting分析或共聚焦图像。 (K 和 L) 在指定HLECs中VEGFR3磷酸化的 Western blotting分析。 (M) 在VEGF-C或rITGA11刺激的HLECs中，有或没有突变VEGFR3的1068酪氨酸残基的VEGFR3磷酸化的西方印迹分析。 (N) 指定HLECs中VE-cadherin表达的代表性荧光图像（上）。通过指定HLECs形成的内皮单层迁移的mCherry标记的RT4细胞的代表性图像和定量（下）。 (O) 代表性生物发光图像和饼图显示指定小鼠的转移性LN（n = 12）。 (P) 指定组中盆腔LN的抗GFP的代表性图像（n = 12）。 (Q) 从指定组的原发BCa组织中识别LVI的代表性荧光图像。

Figure 6 PDGFRa+ ITGA11+ CAFs 通过重塑ECM协助BCa细胞侵入淋巴管

(A) 热图显示scRNA-seq中CAF亚群中不同表达的基因。 (B 和 C) scRNA-seq中PDGFRa+ITGA11+ CAFs的GO功能富集分析。 (D) PDGFRa+ITGA11+ CAFs与其他CAF亚群之间ECM重塑相关信号通路的GSEA分析。 (E) PDGFRa+ITGA11+ CAFs浸润（右）、SHG图像（中）和OrientationJ输出的BCa中胶原纤维的代表性荧光图像（左）。 (F 和 G) BCa组织中胶原纤维方向的归一化分布和定量。 (H) 由CAF亚群形成的基质的代表性图像，通过OrientationJ对胶原纤维排列进行颜色编码。颜色刻度尺代表胶原纤维方向。 (I) 原发BCa组织的PDGFRa+ITGA11+ CAFs浸润、SHG图像和胶原纤维的荧光图。 (J) 由CAF亚群介导的mCherry标记的RT4细胞球在胶原凝胶中的各向同性迁移的代表性图像和定量。 (K 和 L) 细胞因子芯片和CAF亚群之间改变的细胞因子。 (M) 展示scRNA-seq中CAF亚群之间差异基因的火山图。 (N) scRNA-seq中不同CAF群集中指定细胞因子表达的点图。 (O) scRNA-seq中CAF群集中CHI3L1表达的UMAP图。 (P) CAF亚群CHI3L1分泌的ELISA。 (Q 和 R) BCa组织中PDGFRa+ITGA11+ CAFs浸润和CHI3L1表达的荧光图像和定量（n = 318）。 (S) CAF亚群形成的基质的图像。

Figure 7 PDGFRa+ITGA11+ CAFs 通过分泌CHI3L1激活MMP2

(A–D) 指定CAF的CM中MMP2水平的Gelatin gel zymography和ELISA分析。 (E–G) PDGFRa+ITGA11+ CAFs浸润、CHI3L1和MMP2表达在BCa组织连续切片中的相关性分析。 (H) CAF亚群形成的基质的图像，对胶原纤维排列进行颜色编码。颜色刻度尺代表胶原纤维方向。 (I) PDGFRa+ITGA11+ CAFs介导的mCherry标记的RT4细胞球在胶原凝胶中的各向同性迁移的代表性图像和定量。 (J) 指定小鼠盆腔LN中荧光和HE的代表性图像（n = 12）。 (K) 指定组的盆腔LN转移率。 (L) 指定小鼠中转移性盆腔LN的数量（n = 12）。 (M) 在(O)中呈现的纤维方向的定量（n = 12）。 (N) 指定组原发BCa组织中LVI的百分比（n = 12）。 (O) 指定小鼠的BCa组织中PDGFRa+ITGA11+ CAFs浸润、SHG图像和OrientationJ输出的胶原纤维的代表性荧光图像。 (P) 指定小鼠的BCa组织中LVI的荧光图像（n = 12）。

Figure 8 针对PDGFRa+ITGA11+ CAFs的联合治疗抑制早期BCa的LVI

(A–C) 代表性荧光图像和PDGFRa+ITGA11+ CAFs浸润、CHI3L1和MMP2表达，以及VE-cadherin标示的内皮连接在BCa中的相关性分析（n = 910）。 (D) 建立PDX模型的示意图。 (E) PDX肿瘤组织中PDGFRa+ITGA11+ CAFs和MLD（左）、SHG图像（中）和OrientationJ输出的胶原纤维的代表性荧光图像（右）（n = 24）。颜色刻度尺代表纤维方向。(F–H) PDX肿瘤组织中PDGFRa+ITGA11+ CAFs的数量、PDGFRa+ITGA11+ CAFs与淋巴管的距离，以及淋巴管生成（n = 24）。 (I) 在(E)中呈现的胶原纤维方向的定量（n = 24）。 (J) PDX肿瘤组织中LVI的代表性荧光图像（n = 24）。 (K) PDX肿瘤组织中VE-cadherin表达的定量（n = 24）。 (L) 不同组PDX肿瘤组织中LVI的百分比（n = 24）。

小结

PDGFRa+ITGA11+ CAFs通过识别HLECs上的ITGA11功能性受体SELE，促进淋巴管生成并减少BCa的内皮连接。PDGFRa+ITGA11+ CAFs通过分泌CHI3L1为BCa细胞提供了直接的迁移通道，侵入淋巴血管网络，促进早期BCa的LVI和LN转移的形成。在临床上，通过联合抑制ITGA11和CHI3L1作为针对PDGFRa+ITGA11+ CAFs的潜在治疗策略，用于治疗BCa的LVI和LN转移。