人类淋巴器官中的B细胞亚群分群-1

文章概述

文章标题：《Two subsets of human marginal zone B cells resolved by global analysis of lymphoid tissues and blood》

发表日期和杂志：2022年发表在SCIENCE IMMUNOLOGY上

在线阅读链接：https://doi.org/10.1126/sciimmunol.abm9060

背景介绍

B细胞的功能：

B细胞通过产生成熟的抗体反应和类似先天的抗体反应，以及作为免疫调节剂呈递抗原和分泌细胞因子来维持健康。

淋巴组织的微架构和抗原获取机制：

不同的淋巴组织，如肠道相关淋巴组织（GALT）、脾脏和淋巴结（LNs），具有不同的微架构和抗原获取机制。

淋巴组织的活性：

除了与粘膜表面免疫调节相关的肠系膜淋巴结（mLNs）外，健康成人的大多数淋巴结通常是静止的，缺乏GC。脾脏通常也是免疫学上静止的。

血液与淋巴组织中B细胞的差异：

血液中的B细胞亚群，如循环边缘区B（MZB）细胞，是根据其与脾脏微解剖学共享的表型命名的，但它们在多大程度上是真正相似的尚不清楚。

单细胞实验设计

本研究使用深度表型分析、单细胞转录组学和克隆型分析，确定了人类脾脏、肠系膜淋巴结和阑尾相关淋巴组织中B细胞亚群的特征和相对分布。

MZB细胞亚群的识别：研究特别关注了组织和血液中的两种明确的MZB细胞亚群，分别命名为MZB-1和MZB-2，这些细胞的性质是需要进一步阐明的有争议的领域。

病理学观察：在系统性红斑狼疮（SLE）相关的肾病（lupus nephritis）中，MZB细胞及其前体细胞的耗竭现象只发生在其中一个亚群中。

单细胞转录组数据情况

appendix, spleen, mLN数据链接是：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE193868

样品详情：

GSM5822798 A_APP
GSM5822799 A_MLN
GSM5822800 A_SPL
GSM5822801 B_APP
GSM5822802 B_MLN
GSM5822803 B_SPL
GSM5822804 C_APP
GSM5822805 C_MLN
GSM5822806 C_SPL

正常人和狼疮患者血液中B细胞单细胞数据链接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE193867

样品详情：

GSM5822786 HCD_1
GSM5822787 HCD_2
GSM5822788 HCD_3
GSM5822789 SLE_1
GSM5822790 SLE_2
GSM5822791 SLE_3

提供的都是tar.gz的压缩文件，里面包含了10X的标准三文件，解压开之后进行整理即可使用Read10X()函数读取，然后创建seurat对象进行后续的降维聚类分群

文章单细胞分析流程

1. 数据过滤：根据线粒体转录本的高表达、每个细胞独特基因数量的高低、以及总RNA转录本的多少，筛选出了CD19+ B细胞。使用的阈值是每个样本平均绝对偏差的三倍。
2. B细胞的分离：基于B细胞特异性基因（CD79A、CD79B、CD19和MS4A1）的表达，以及缺乏T细胞特异性基因（CD2、CD3D、CD3E、CD3G、CD4、CD8B和CD7）和TCR基因，来分离B细胞。
3. 基因过滤：从整个数据集中移除了只在10个或更少细胞中表达的基因。此外，在下游分析前，移除了IGHV和TCR基因。
4. 数据转换和整合：使用SCTransform和整合工作流程对数据进行了转换和整合。
5. 主成分分析（PCA）：为了更有效的聚类和降维，对3000个转录组变量特征进行了PCA，并使用了前25个主成分进行下游分析。
6. 聚类分析：使用Seurat的标准聚类方法，设置分辨率为1.3，对细胞进行聚类。
7. 差异表达基因的鉴定：使用Wilcoxon秩和检验确定显著差异表达的基因，阈值设置为0.25的对数倍数变化，并且这些基因在任一群体中的表达超过10%。
8. 聚类注释：具有相似差异表达基因列表的聚类被合并，所有聚类都使用表S3中显示的基因列表进行了注释。
9. 基因集富集分析（GSEA）：使用Broad Institute的GSEA软件进行，所有相关的NOTCH基因集从分子签名数据库下载，并针对数据集的背景进行了校正。
10. RNA速度计算：使用scVelo获取剪接和未剪接RNA计数矩阵，并计算RNA速度。

文章主要结果简介

B细胞表型变异在组织中的丰度差异

使用了一组包含28种抗体的检测板来调查人类淋巴组织中B细胞的变化，使用Cydar包进行了UMAP分析，比较了不同组织中B细胞的分布差异，并且分析了所有标记（除了免疫球蛋白G，IgG）的表达强度。

Cydar生成的“超球”代表了在UMAP上位置相似且中位标记强度相似的细胞群。只有包含100个或更多细胞的超球被用于下游分析。

在UMAP上可视化了各个超球内的标记表达，包括CD27、IgD、IgM和IgA，这些标记有助于广泛分类B细胞。

进行了三种组织的超球丰度差异比较。在组织间丰度有显著差异的超球主要是CD27+IgM+，表明主要的组织间变异性存在于未转换的、有抗原经验的细胞中。

使用层次聚类和k-means方法比较了在不同组织中丰度有显著差异的超球的表型特征

识别了五个主要的CD27+超球聚类和一个CD27-聚类，每个聚类的超球根据树状图进行颜色编码，并在UMAP上定位。

CD27-超球的特征：在第二聚类中发现了一个单一的CD27-超球，在脾脏中丰度显著更高，包含表达IgM、IgD、CCR7和CD10的细胞，但没有高表达特征性的过渡型(TS) B细胞标记物CD38或CD24。

MZB细胞亚群的特征：与第二聚类最接近的两个聚类（第三和第四聚类）在脾脏中也相对更丰富，具有CD27+IgM+IgD+的MZB细胞表型。尽管两者在表型上都类似于MZB细胞，但被指定为MZB-1的亚群在CCR7、BAFFR、CD24和CD27的表达上显著高于被指定为MZB-2的亚群。

其他超球聚类的特征：剩余的超球聚类（第一、第五和第六聚类）在GALT和mLN中最丰富，包括表达IgA的B细胞，包括一些表达CD10的GC变异型（第一聚类）、表达IgM的GC细胞（第五聚类）和具有表型CD27+IgM+IgD-的IgM-only细胞（第六聚类）。

MZB-1和MZB-2分析

为了更直接地量化MZB-1和MZB-2之间的丰度差异，使用viSNE和SPADE将B细胞亚群识别并分组为气泡，并基于CCR7表达对MZB亚群进行了细分。

BAFFR、CD24和CD27的表达与无监督分析中发现的两个MZB亚群的表型一致。

当合并三种组织的数据时，MZB-1细胞的丰度显著高于MZB-2细胞（P < 0.05，方差分析ANOVA）。两种MZB亚群在脾脏中的丰度都高于其他组织。

单细胞分析B细胞在不同组织中的复杂性

对不同三组组织样品的单细胞数据进行了分析，通过UMAP验证了细胞没有根据捐献者分离，根据3000个可变基因的表达，识别了细胞聚类，在UMAP上可视化了关键基因和细胞表面标记的表达。

识别了15个不同的B细胞聚类，包括过渡型（TS）、幼稚型、活化幼稚型（aNAV）、生发中心（GC）和类别转换记忆B细胞。并根据转录组特征和细胞表面表型进行了命名，使用UMAP进行了可视化。

不同亚群特征基因

aNAV亚群特征：aNAV亚群作为抗体分泌细胞的前体，其特征是高表达CD19和ITGAX（CD11c），以及低表达CXCR5、CD24和CD38。

活化B细胞亚群（AcB）：识别了四个表达活化标记但没有经典GC标记（BCL6和BCL7a）的细胞聚类，被命名为AcB1至AcB4。

• AcB1与GC B细胞最为相似，表达JUN、JUNB和FOS。
• AcB2表达增殖抗原PCNA，但缺乏其他活化标记。
• AcB3因表达长非编码RNA MALAT1而被指定为“活化”，MALAT1与类别转换有关。
• AcB4具有强烈的干扰素调控基因特征，表明可能通过这一途径被激活。

双阴性（DN）聚类：两个小的不相邻聚类因缺乏CD27和IgD而被命名为DN，但它们并没有根据血液DN细胞亚群的传统特征进行分离。

MZB细胞聚类：根据细胞表面CD27+IgM+IgD+表型和CD27、IGHM、IGHD、CD1C和PLD4转录本的存在，识别了两个MZB细胞聚类。

体细胞高频突变（SHM）

• 记忆B细胞中SHM程度最高，而幼稚和TS B细胞中最低。
• GC B细胞经历了相对较少的SHM轮次。
• AcB1至AcB3聚类各自经历了适度的SHM。
• 在所有组织中，MZB-2细胞的SHM水平显著低于MZB-1。

B细胞亚群的组织分布

比较了不同组织中B细胞亚群的相对丰度

• GC细胞和AcB1细胞在阑尾中比在mLN或脾脏中更丰富。
• IgM-only B细胞和AcB3细胞在mLN中比在阑尾中更丰富。
• 与脾脏相比，MZB-1亚群在阑尾中的比例偏低，而mLN中的数目与脾脏相似。
• MZB-2细胞的频率低于MZB-1细胞，但在任何组织位点的相对丰度没有显著更多或更少。

未完待续

文章分析的内容较多，但一篇推文可整理的内容有限，所以将这篇文献拆成两篇推文，下篇我们来看看文章其他的分析结果。