转录组测序分析

转录组数据分析一般流程

转录组测序原理

SBS（Sequencing-By-Synthesis）：

通过单分子阵列实现在小型芯片（Flowcell）上进行 桥式PCR反应。通过可逆阻断技术实现每次只合成一个碱基，再利用四种带有不同荧光标记的碱基，通过荧光激发/捕获，读取碱

基信息

基于 可逆终止的、荧光标记dNTP，边合成边测序

转录组:组织或所有细胞中包含所有类型的RNA转录集合

mRNA： RNA-Seq，普通转录组测序

lncRNA：lncRNA-Seq，一般采用链特异性测序

miRNA： miRNA-Seq，小RNA测序

circRNA: cirRNA-seq，一般有两种，消化性线性RNA

建库或者去rRNA建库

转录组测序实验流程

1. 样本检测：

高质量的RNA是整个项目成功的基础。我们使用以下方法对样品进行检测，检测结果达到要求后方可进行建库：

(1) Nanodrop检测RNA的纯度（OD260/280）、浓度、核酸吸收峰是否正常；

(2) Agilent 2100精确检测RNA的完整性，检测指标包括：RIN值、28S/18S、图谱基线有无上抬、5S峰。

2. 文库构建

(1) 磁珠富集真核生物mRNA（此步骤对RNA的完整性要求比

较高， 一般RIN值要大于8）；

(2) mRNA进行随机打断；

(3) 以mRNA为模板，合成第一条cDNA链和第二条cDNA链

(4) 进行末端修复、加A尾并连接测序接头，然后进行片段大小

选择；

(5) 最后通过PCR富集得到cDNA文库。

文库构建完成后，对文库质量进行检测，检测结果达到要求后方可进行上机测序，

检测方法如下：

(1) 使用Qubit进行初步定量，使用Agilent 2100对文库的插入片段（insert size）进行检测，insert size符合预期后才可进行下一步实验。

(2) Q-PCR方法对文库的有效浓度进行准确定量（ 文库有效浓度＞2nM），完成库检。

桥式PCR扩增

把文库种到芯片上去，然后扩增，文库两头的DNA序列与芯片上的引物互补，互补杂交杂交完后，加入dNTP和聚合酶，合成双链，加入NaOH碱溶液，双链解开，加入中性液体，环境变成中性。

上机测序完成之后得到的 测序数据：FASTQ文件

FASTQ数据格式

fastq数据：高通量测序（如Illumina NovaSeq等测序平台）得到的原始图像数据文件，经碱基识别（Base Calling）分析转化为原始测序序列（Sequenced Reads），我们称之为Raw Data或Raw Reads，结果以FASTQ（简称为fq）文件格式存储。

FASTQ格式文件中每个Read由四行描述

• 第一行以“@”开头，随后为Illumina测序识别（Sequence Identifiers）和描述文字（选择性部分）；

• 第二行是碱基序列；

• 第三行以“+”开头，随后为Illumina测序识别符（选择性部分）；

• 第四行是对应序列的测序质量的ASCII码。