转录组概述-1

生信技能树学习笔记

关于转录组的综述

• A comprehensive evaluation of normalization methods for illuminating high-thoughput RNA sequencing data analysis

• Methods to study splicing from high-throughput RNA sequencing data

• A survey of best practices for RNA-seq data analysis

• hppRNA-a snakelike-based handy parameter-free pipeline for RNA-seq analysis of numerous samples

• Gaining comprehensive biological insight into the transcriptome by performing a broad-spectrum RNA-seq analysis

• RNA sequencing: the teenage years

转录组分析的一般流程

转录组分析的几种策略

A和b是有参考序列的c是没有参考序列的物种，a是以基因组为参考序列，b是以转录组为参考序列。分析过程中用到的软件不同。

测序原理

1.中心法则

2.转录组是指所有RNA的转录本，可以是单个细胞也可以是一群细胞。RNA分为编码和非编码RNA，非编码RNA又可以分为

RNA根据质量（A）和数目（B）排序，如下

主要在于建库方式有所不同，提取RNA对象不同

• mRNA：RNA-Seq，普通转录组测序

• lncRNA：lncRNA-Seq，一般采用链特异性测序

• miRNA：miRNA-Seq，小RNA测序

• circRNA: cirRNA-seq，一般有两种，消化性线性RNA建库或者去rRNA建库。

普通转录组测序流程

1.RNA样品检测

高质量的RNA是整个项目成功的基础。我们使用以下方法对样品进行检测，检测结果达到要求后方可进行建库：

(1) Nanodrop检测RNA的纯度（OD260/280）、浓度、核酸吸收峰是否正常；

(2) Agilent 2100精确检测RNA的完整性，检测指标包括：RIN值（>8.0）、28S/18S、图谱基线有无上抬、5S峰。

对于降解样本难以获取完整的转录本信息，影响数据质量及完整性。

当RNA总量较低时，会导致建库成功率低，或数据dup率高等问题。

2100峰图：如下是两个RNA样品2100检测结果示例。

2. 样品检测合格后，进行文库构建，主要流程如下：

(1) 磁珠(上面带TTTTT..结构)富集真核生物mRNA（有polyA尾）（此步骤对RNA的完整性要求比较高，一般RIN值要大于8）；

(2) mRNA进行随机打断；

(3) 以mRNA为模板，合成第一条cDNA链和第二条cDNA链

(4) 进行末端修复、加A尾并连接测序接头，然后进行片段大小选择；

(5) 最后通过PCR富集得到cDNA文库。

文库：连接好接头的cDNA，叫做文库，英文为library

Y字接头：自身不配对，可以有效避免接头在连接的过程中自连接，用途是与flowcell上的接头进行连接

插入的cDNA序列是各种各样的

index：一段特定的序列，标记不同来源的样本6-8个碱基

read2测序引物结合位点：在Index序列的旁边GAT

文库构建完成后，对文库质量进行检测，检测结果达到要求后方可进行上机测序，检测方法如下：

(1) 使用Qubit2.0进行初步定量，使用Agilent 2100对文库的插入片段（insert size）进行检测，insert size符合预期后才可进行下一步实验。

(2) Q-PCR方法对文库的有效浓度进行准确定量（文库有效浓度＞2nM），完成库检。

库检合格后，不同文库按照目标下机数据量进行pooling，用Illumina Novaseq平台进行测序。主要有以下四个步骤：

SBS（Sequencing-By-Synthesis）：

通过单分子阵列实现在小型芯片（Flowcell）上进行桥式PCR反应。通过可逆阻断技术实现每次只合成一个碱基，再利用四种带有不同荧光标记的碱基，通过荧光激发/捕获，读取碱基信息

基于可逆终止的、荧光标记dNTP，边合成边测序

芯片：

8条通道：内表面做了专门得化学修饰，布满了短的oligo 序列（P7/P5接头）2中DNA引物，种在玻璃表面，通过共价键连接。

液流孔：

每个lane的两端，液流流进、流出的地方

Flowcell中的每条Lane的每个面各被扫描三个道，每个道被称为一个swath。

把文库种到芯片上去，然后扩增，文库两头的DNA序列与芯片上的引物互补，互补杂交杂交完后，加入dNTP和聚合酶，合成双链，加入NaOH碱溶液，双链解开，加入中性液体，环境变成中性。

问：为什么进行桥式PCR？

扩增，增加荧光强度

问：为什么测序两次？

从两端测，合称为一条链，如图所示：