Cell 关于 小和长非编码RNA 的最新综述，万字精读

Basic Information

• 英文标题： Small and long non-coding RNAs: Past, present, and future
• 中文标题：小和长非编码 RNA：过去、现在和未来
• 发表日期：14 November 2024
• 文章类型：Review
• 所属期刊：Cell
• 文章作者：Ling-Ling Chen | V. Narry Kim
• 文章链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867424012066

Summary

Para_01

1. 自从1958年分子生物学中心法则的提出以来，各种RNA种类已被发现。
2. 信使RNA将DNA中的遗传指令传递给蛋白质合成过程，这一过程由小核RNA（snRNA）、核糖体RNA（rRNA）和转运RNA（tRNA）等管家非编码RNA（ncRNA）协助完成。
3. 在过去的四十年里，一系列调控性ncRNA作为基因调控的关键角色逐渐显现。
4. 为了庆祝《细胞》杂志成立50周年，这篇综述探讨了我们对研究最深入的调控性ncRNA——小RNA和长非编码RNA（lncRNA）的当前理解，这些RNA深刻地影响了RNA生物学及其他领域。
5. 虽然小RNA途径已有明确的机制记录，但lncRNA表现出更大的机制多样性，其中许多机制仍未知。
6. 这篇综述涵盖了它们发现、生物发生途径、进化特征、作用机制、功能以及ncRNA之间相互作用的关键事件。
7. 我们还强调了它们在病理生理背景下的作用，并提出了未来的研究方向，通过借鉴小RNA的经验来解析lncRNA的未知领域。

Keywords

• microRNAs; long non-coding RNAs; regulatory ncRNAs; ncRNA biogenesis; ncRNA evolution; ncRNA function; ncRNA mechanism; ncRNAs in diseases

Introduction

Para_01

1. 非编码RNA（ncRNA）是不翻译成蛋白质的转录产物，具有多样化的生物发生、大小、形状和功能。
2. ncRNA的首次发现可以追溯到1950年代中期，当时George Palade和Paul Zamecnik分别鉴定出了核糖体RNA（rRNA）和转运RNA（tRNA）。
3. 这些努力促成了分子生物学‘中心法则’的早期建立，该法则后来由Francis Crick强调指出，"必须有一种‘适配器’分子用于RNA到氨基酸的翻译。"
4. 在信使RNA（mRNA）的发现和蛋白质编码理论的建立之后不久，管家ncRNA，包括小核RNA（snRNA）和小核仁RNA（snoRNA），以及它们在RNA加工中的作用也被发现了。
5. 1970年代通过电子显微镜也在细胞质中观察到了环状转录本。
6. 然而，由于它们在细胞中的丰度较低，直到最近才被认为是RNA加工的副产品，具有有限的功能潜力。
7. 从细菌中鉴定出了源自编码基因互补序列的转录本，但这些转录本被认为是一种"细胞垃圾"。
8. 尽管如此，早期的先驱者有远见地意识到，"成为垃圾并不意味着完全没有用处"，从1970年代开始，这些非编码序列就持续引起了人们的兴趣。
9. 自此，非编码RNA的世界的大门已经打开（图1）。

• 图1. 数十年来小RNA和长非编码RNA的关键发现 时间线始于20世纪50年代核糖体RNA（rRNA）和转运RNA（tRNA）的鉴定，并逐渐发展到数十年来的非编码RNA（ncRNA）概念。
• 除了早期意外发现的小RNA和长非编码RNA及其潜在调控作用外，多年来技术的进步极大地促进了不同ncRNA的注释、生物发生、作用模式和功能的理解。
• 这些知识可能为现在和未来的基于RNA的诊断和治疗设计提供信息。详见正文。

Para_01

1. 在这里，我们介绍了目前对最广泛研究的非编码 RNA——微小 RNA（miRNAs）和长链非编码 RNA（lncRNAs）的理解，这些 RNA 贡献了真核生物中的现代调控 RNA 领域。
2. miRNA 的途径和机制已经得到了详细的定义和理解，而 lncRNAs 在机制上非常多样，存在许多未知之处。
3. 我们回顾了它们发现的关键里程碑、生物发生途径、进化特征、作用模式、相互作用以及发育和病理生理作用。
4. 我们还推测，对其调控机制的理解如何能够促进技术和治疗的进步，并讨论未来更好地解析小 RNA 和 lncRNAs 复杂性的方向。

Discovery of small RNAs and lncRNAs

Para_01

1. ncRNA生物学早期的一个重要里程碑是1984年从大肠杆菌中发现和表征了microRNA F（micF）。
2. 这种93核苷酸的RNA是第一个被报道具有调控潜力的ncRNA，它通过与编码外膜蛋白F（OmpF）的mRNA配对起作用。
3. 后续研究表明，micF结合到OmpF mRNA的核糖体结合位点，阻止核糖体进入并抑制翻译。
4. 后来证明，这种机制是细菌ncRNA功能的主要模式之一。
5. 另一种重要的细菌ncRNA，长度为184核苷酸的6S RNA，最初于1967年被检测到，尽管其功能研究直到2000年才滞后进行。
6. 6S RNA与RNA聚合酶的sigma 70亚基相互作用，通过充当DNA泡的结构模拟物干扰转录，防止RNA聚合酶与启动子结合。

Para_02

1. 在真核生物中，调控性非编码 RNA 的发现经历了一条曲折的道路。
2. 1990年，一种被称为 H19 的人类长非编码 RNA 被鉴定为母系印记转录本之一。
3. H19 长 2.3 千碱基，表达丰富，具有 mRNA 的特征——除了它缺乏编码潜力。
4. 它由 RNA 聚合酶 II (RNAPII) 转录；经过加帽、剪接和多聚腺苷酸化；并定位于细胞质中。
5. 自那时起，人们普遍接受的定义是，长度超过 200 个核苷酸的非编码 RNA 被分类为长非编码 RNA。
6. 将额外的 H19 基因拷贝引入转基因小鼠导致了胚胎致死，表明其在发育中的关键作用。
7. 最近的研究显示，这种第一个被发现的真核生物长非编码 RNA 实际上作为称为 miR-675-5p 和 miR-675-3p 的小 RNA 的宿主转录本。

Para_03

1. 早在20世纪90年代初，真核小RNA的存在还不为人所知，但在植物中记录了一些有趣的基因沉默现象：引入转基因导致相应内源基因的抑制，但不影响它们的转录，这表明这种"共抑制"是通过序列特异性的转录后过程起作用的，尽管其潜在的分子机制仍然神秘。
2. 1993年，Victor Ambros和他的同事们做出了一个开创性的发现，即一个发育基因lin-4在秀丽隐杆线虫中产生约22个核苷酸长度的小RNA。
3. 此外，与Gary Ruvkun的团队一起，他们发现lin-4 RNA与lin-14 mRNA的3'非翻译区（UTR）中的多个位点互补，从而导致翻译抑制。
4. 第二种miRNA，let-7，是在秀丽隐杆线虫中进行控制发育时间的基因遗传筛选时被鉴定出来的。
5. 发现let-7在双侧动物中广泛保守，这表明内源性小RNA的普遍性。
6. 在独立的研究中，在植物的转录后基因沉默过程中发现了大约21-25个核苷酸的短RNA，以及在果蝇中由dsRNA诱导的RNA干扰（RNAi）。
7. 这些研究共同显示了在看似不相关的进程和远缘物种之间的小RNA具有令人好奇的相似性。
8. 最后，在线虫的遗传筛选中鉴定了参与RNAi的因子（如Dicer和Ago同源物），并显示它们也是lin-4产生的必需条件，从而建立了不同小RNA途径之间的联系。

Para_04

1. 这些发现引发了一系列激动人心的发现。
2. 从线虫、果蝇和人类细胞中发现了超过一百种小RNA，表明存在一个丰富、多样且保守的小非编码RNA类群，随后被命名为"miRNAs"。
3. miRNA途径涉及逐步处理和核输出，这一假设最早在2002年提出，为识别关键生物合成因子如RNAPII、Drosha、DGCR8和外运蛋白-5以及阐明它们的生化机制奠定了基础。
4. 2000年代中期深度测序技术的出现使得对小RNA的广泛探索成为可能，揭示了众多动物、植物和病毒中的小RNA，并揭示了其他相关的小非编码RNA类群，如内源性小干扰RNA（endo-siRNAs）和PIWI相互作用RNA（piRNAs）。
5. 后续研究提供了关于它们生物合成和作用机制细节的见解，揭示了它们的生物学和病理功能，并确立了小RNA作为一种有前景的治疗模式。

Para_05

1. 与小 RNA 相比，由于长非编码 RNA（lncRNA）的细胞丰度较低、生物化学机制多样以及早期缺乏无偏检测方法，lncRNA 的发现进展相对较慢。
2. 然而，在 1990 年代和 2000 年代初报告了几个例外。
3. 除了 H19，长非编码 RNA X 染色体特异性转录本（XIST）于 1991 年被描述，该转录本从人类 X 染色体失活中心（XIC）区域表达，并且仅定位于与 X 染色体失活相关的巴尔体。
4. XIST RNA 是 X 染色体失活（XCI）所必需的，这是一个在胚胎发育过程中实现女性 X 染色体剂量补偿的过程。
5. 在同一时期，发现了不翻译的 RNA enod40，它可能在植物生长中发挥作用。
6. 此外，当时还报道了几种其他 lncRNA 调控基因组印记。
7. Air 长达 108 kb，父系表达，对于顺式连锁基因的等位基因特异性沉默是必需的，包括通过招募组蛋白 H3K9 甲基转移酶（MTase）G9a 来沉默 Igf2r。
8. 同样，父系转录的 90.5 kb 长的 Kcnq1ot1 与其相邻的印记基因的双向沉默有关，这通过以谱系特异性方式招募 G9a 和多梳抑制复合物 2（PRC2）来实现。
9. 尽管将内源性 Air 位点缩短到不同长度的研究表明，沉默只需要 Air 转录覆盖 Igf2r 启动子，质疑了 lncRNA 产物在邻近基因沉默中的作用，但对 Air 和 Kcq1ot1 的早期研究仍然暗示了 lncRNA 在基因调控中的有趣角色。
10. 与此同时，还描述了如 Evf-2、泛素蛋白连接酶 E3A 反义（Ube3A-ATS）和 BMP/OP 响应基因（BORG）等几种其他 lncRNA，它们具有潜在的细胞分化和发育模式的功能，作用模式各不相同。

Para_06

1. 对长非编码 RNA（lncRNAs）广泛表达的关注始于阵列和测序技术的出现。
2. 2002年，小鼠全长cDNA文库的测序揭示了超过11,000种新的非编码转录本，包括lncRNAs，表明ncRNAs是转录组的重要组成部分。
3. 类似的结果也在人类染色体21和22的平铺阵列研究中被发现。
4. 这些努力促进了新 lncRNA 种类及其调控作用的进一步探索。
5. 核富集的丰富转录本1（NEAT1）和NEAT2（也称为与肺腺癌转移相关的转录本1[MALAT1]）很快就被发现保守并定位于细胞核中。
6. 它们的大小从3到约6千碱基不等，通过Northern印迹得到验证，它们的亚细胞定位模式通过RNA荧光原位杂交（FISH）显示，表明它们与SC35剪接域相关，可能在mRNA代谢中发挥作用。
7. 后来发现，MALAT1和NEAT1的长异构体主要是非多聚腺苷酸化的，其3'端由RNase P处理。
8. 同时，关于lncRNAs的功能研究也开始涌现。
9. NEAT1被发现对于维持核寄斑至关重要，而MALAT1则定位于参与剪接调节的核斑点。
10. 与此同时，通过覆盖四个高分辨率人类HOX位点的定制平铺阵列，揭示了一组显著的lncRNAs，包括2.2 kb长的HOTAIR。
11. HOTAIR从HOXC位点转录，但似乎在跨40 kb的HOXD位点上抑制转录。
12. 自那时起，lncRNAs的研究开始蓬勃发展。

Para_07

1. 2007年启动的DNA元素百科全书（ENCODE）项目标志着一个重要的进展，使得人类基因组中的非编码信息得以广泛编目，并将长链非编码RNA（lncRNA）注释推进到了大规模时代。
2. RNA测序（RNA-seq）与染色质标记和多聚腺苷酸位点映射、基于CRISPR-Cas9的基因编辑介导的功能丧失和功能获得方法，以及单分子荧光原位杂交（smFISH），特别是结合高分辨率成像技术，解析lncRNA在亚细胞和亚细胞器水平上的定位（例如XIST、NEAT1，以及5'端加帽和3'端多聚腺苷化的lncRNA SPA90），进一步促进了不同lncRNA的识别、机制理解及功能探索。
3. 迄今为止，人类DNA元素百科全书（GENCODE）数据库已编录超过20,000个lncRNA基因（https://www.gencodegenes.org/human/stats_46.html），而其他数据库估计存在超过100,000个人类lncRNA。
4. 这些包括来自启动子上游序列的转录本（PROMPTs）、增强子（eRNAs）、编码基因的反义转录本（NATs），以及主要从基因间区域表达的lncRNA（也称为lincRNAs）。
5. NATs和lincRNAs类似于mRNA，因为它们是加帽和多聚腺苷化的。
6. 受非多聚腺苷化MALAT1和NEAT1长异构体的启发，应用了非多聚腺苷化RNA测序和其他富集方法来揭示非常规加工的ncRNAs，如末端为小核仁RNA的lncRNA（sno-lncRNAs）和环状RNA。
7. 过去十年里，人们为表征它们的特征、生物发生和作用机制做出了许多努力。
8. 然而，鉴于它们相对较低的水平、大小各异、构象不确定性和通常模糊的功能角色（如果有的话），对lncRNA的全面理解之路仍在展开。

Evolutionary traits of ncRNAs

Evolution of miRNA

miRNA的进化

Para_01

1. miRNAs 属于一类更广泛的非编码 RNA（ncRNAs），被称为"小 RNA"，其特征是大小（20-28 个核苷酸）和与 Argonaute (Ago) 家族蛋白的关联。
2. 小 RNA 作为引导分子，指导 Ago 蛋白定位到目标核酸，从而诱导基因沉默。
3. 这一过程称为"RNA 沉默"，可能是在真核生物的最后一个共同祖先中为了防御外来遗传物质（如病毒和转座子）而产生的。

Para_02

1. 在动物中，至少存在三种主要的小 RNA：小干扰 RNA（siRNA）、PIWI 相互作用 RNA（piRNA）和微 RNA（miRNA）。
2. siRNAs 来源于长双链 RNA，在无脊椎动物物种中广泛存在，它们抑制转座子和病毒。
3. 在哺乳动物中，siRNAs 主要局限于生殖细胞和胚胎干细胞。
4. 据认为，miRNA 途径是从祖先 siRNA 途径进化而来的，因为两者都依赖于双链前体、III 型 RNase 酶（Drosha 和 Dicer）以及 Ago 家族的 AGO 亚家族成员。
5. miRNAs 调节内源性蛋白质编码转录本，并对体细胞和生殖细胞谱系的发育至关重要。
6. piRNAs 与 siRNAs 和 miRNAs 的关系较远。它们以单链前体的形式在不依赖于 RNase III 的方式下产生，并与 Ago 家族的 PIWI 亚家族成员相互作用，特异性地在生殖细胞中沉默转座子。
7. 动物和植物 miRNAs 在生物发生和功能机制上有相关性，但据认为它们是独立进化的。
8. 本综述将重点讨论动物 miRNAs，它们与编码转录本和非编码 RNA 密切交织，并影响人类疾病的许多方面。

Para_03

1. miRNAs 构成了人类最大的基因家族之一。
2. 根据最新的 miRNA 数据库（miRBase 22.1 版本），已记录了 1,907 个人类 miRNA 基因，以及 265 个黑腹果蝇和 250 个秀丽隐杆线虫的 miRNA 基因。
3. 然而，由于许多这些注释仅基于深度测序，且超过一半的注释人类 pri-miRNAs 在体外无法被 DROSHA 切割，因此已经做出了努力，通过考虑生物发生证据和序列保守性来精炼 miRNA 注释并删除错误条目。
4. 这导致了 miRGeneDB 3.0 中 miRNA 基因的更保守和准确估计，包括 567 个人类、161 个黑腹果蝇和 145 个秀丽隐杆线虫的 miRNA 基因。
5. 这些高可信度的 miRNAs 可以根据它们的"种子区域"序列（核苷酸 2-8）分为家族，这对于与目标 mRNA 的特异性配对至关重要。
6. 例如，mir-99/100 家族的 miRNAs 从刺胞动物（如海葵）到两侧对称动物（如人类）都是保守的，而 lin-4/mir-125 家族和 let-7 家族则分布在两侧对称动物中（如人类、苍蝇和线虫）。
7. 目前，177 个种子家族被认为在胎盘哺乳动物中保守，89 个在脊椎动物中保守，27 个在两侧对称动物中保守。
8. 除了种子区域之外，miRNA 基因通常在其 3' 区域（补充种子配对）和发夹结构的反义链（由于生物发生的结构要求）中也是保守的。
9. 这些保守模式有助于跨物种识别 miRNA 同源物。

• 图2. 小RNA和lncRNA的进化特征和保守性 (A) 后生动物miRNA的进化和保守性。Drosha和Dgcr8的同源物在海绵等多孔动物物种中被发现，这表明miRNA途径在后生动物的共同祖先中出现，尽管miRNA途径在某些后生动物谱系中已经丢失。miRNA基因和家族的数量来自miRGeneDB 3.0。
• (B) 一个保守的miR-125家族的例子。(上) 显示了人类pri-mir-125a的一部分二级结构，其中从发夹的5'臂（miR-125a-5p）和3'臂（miR-125a-3p）产生的引导链和乘客链用洋红色表示。这些结构和序列来自miRBase。(下) miR-125家族成员的比对，包括C. elegans的lin-4和人类的miR-125a。保守的种子区域（位置2-8）用一条线表示。
• (C) 根据Necsulea等人简化后的lncRNA系统发生树。从爪蟾到人类，lncRNA的数量总体上随着进化而增加。系统发生树的顶端和每种生物中lncRNA数量的增加都有所指示。
• (D) lncRNA保守性的分类。(1) 序列保守的lncRNA同源物。由于lncRNA的进化速度通常快于编码序列或miRNA，因此人类与小鼠之间典型的序列保守的lncRNA显示出不少于20%的跨物种同源性。
• (2) 转录和加工保守的lncRNA同源物。这类lncRNA同源物通常从不同物种的同源位点转录。
• (3) 位置保守的lncRNA，具有保守的转录区，而外显子位置和成熟的lncRNA序列则中性进化。位置保守的lncRNA通常相对于正交蛋白编码基因和/或其他保守区域处于相同的相对方向。
• (4) 结构保守的lncRNA，尽管缺乏序列同源性，但折叠成相似的二级或三级结构。结构保守的lncRNA有时被定义为"缺失"的同源物，即使用初级序列保守性同源性尚未被识别。

Para_03

1. 由于广泛的测序努力，保守的 miRNA 基因列表可能已经接近完整，可能除了那些表达水平非常低和/或在特定细胞类型中表达的基因。
2. 除了保守的 miRNA 外，还发现了数百个保守性较差的 miRNA，表明它们正在快速进化、获得和丢失。
3. 这些基因是通过现有 miRNA 基因的复制和分化，或者通过新发夹结构的从头进化而产生的。
4. 虽然一些年轻的 miRNA 可能会在谱系或物种特异性角色中发挥作用，并与其靶基因共同进化，但许多位点可能在功能整合到基因网络之前就已经丢失。

The complexity of lncRNAs in evolution

lncRNAs在进化中的复杂性

Para_01

1. 与蛋白质编码基因或 miRNAs 不同，lncRNAs 在进化过程中迅速丢失和获得；因此，lncRNAs 的保守性更为复杂。
2. 编码外显子的进化速度比基因间区域慢，但大多数 lncRNAs 的初级序列保守性较低，尤其是来自远缘物种的 lncRNAs。
3. 例如，在斑马鱼中鉴定出约 550 个 lncRNAs 具有哺乳动物 lncRNAs 的特征，但只有 29 个具有与假定的哺乳动物直系同源物的序列相似性，通常具有高度保守的短区域。
4. 使用吗啉代干扰斑马鱼 lncRNAs 导致发育缺陷，通过添加其人类或小鼠直系同源物可以挽救这种缺陷。
5. 然而，最近基于 CRISPR 技术的保守 lncRNAs 耗竭表明在斑马鱼中没有明显的功能。
6. 尽管如此，一些其他基因间的 lncRNAs 有保守的基因组位置，但没有可检测到的序列保守性。
7. 进一步的全基因组比对显示，20% 的人类 lncRNAs 在小鼠中有同源物，而约 99% 的人类蛋白质编码基因有一个小鼠同源物。
8. 此外，lncRNAs 通常缺乏长的、对序列高度约束的区域（这对于蛋白质编码基因的比较分析至关重要）或对二级结构高度约束的区域（这对于短 RNA 的比较分析至关重要）。
9. 虽然开发能够准确捕捉 lncRNAs 进化约束的模型具有挑战性，但已经开发出了在各种四足动物中全面映射和比较 lncRNA 序列和表达进化的综合方法。
10. 尽管需要更多的实验验证，这些努力已经提供了广泛的进化视角，作为促进 lncRNAs 功能研究的指标。

Para_02

1. 尽管核苷酸或氨基酸序列的比较研究已被证明对蛋白质编码基因有价值，但这一简单标准对于全面理解 lncRNA 的选择过程来说过于狭窄。
2. 来自不同物种的 lncRNA 的保守性可以在多个维度进行分析，包括序列保守性、转录/加工状态的保守性、位置保守性和结构保守性。
3. 大多数被认为是保守转录本的 lncRNA 实际上仅共享一些关键元素，这使得准确捕捉保守性变得具有挑战性。
4. 到目前为止，只有少数 lncRNA，如 XIST（5'端）、MALAT1、NEAT1、NORAD 和 CHASERR，已经被很好地注释并定义为保守转录本。

Para_03

1. 一些长链非编码RNA在物种之间没有可检测到的序列相似性，但它们在接近或与蛋白质编码基因反义的位置从相同的基因位点转录。这些长链非编码RNA被认为是位置保守的。
2. 其中一些通过调节邻近基因的表达在物种间保持顺式模式，表明至少在某些情况下，长链非编码RNA位点的转录而非长链非编码RNA本身可能解释观察到的表型。
3. 例如，长链非编码RNA Air仅需其转录覆盖Igf2r启动子即可沉默胰岛素样生长因子2受体（IGF2R）的表达，而Air RNA的其他方面是可有可无的。
4. 此外，保守的长链非编码RNA可能会经历不同的加工过程，导致不同的亚细胞定位模式，从而具有不同的功能。人类FAST定位于细胞质，在那里它促进维持多能性所需的Wnt信号传导；然而，小鼠Fast的加工被剪接抑制剂肽基脯氨酰异构酶E（PPIE）抑制，并定位于细胞核，没有可检测到的功能。

Para_04

1. 更广泛地说，具有类似结构的长非编码RNA（lncRNAs），如不完美的发夹结构和RNA结合蛋白（RBP）相互作用元件，被认为是结构保守的。
2. 例如，人类的长非编码RNA HULC和小鼠的长非编码RNA Pair都通过一个关键的茎环结构与苯丙氨酸羟化酶（PAH）相互作用并调节其活性，从而调节苯丙氨酸水平以维持肝脏中的代谢稳态。
3. 具有类似功能的此类lncRNAs（如HULC和Pair）也可以被视为功能保守的。
4. 因此，lncRNA的保守性可能由不同的标准定义（图2D），但对于大多数lncRNA而言，从进化的角度来看，lncRNA加工和结构如何与功能联系起来仍需进一步验证。

Biogenesis and modification of ncRNAs

The well-defined biogenesis pathways of miRNAs

miRNA 的明确定义的生物发生途径

Para_01

1. miRNA 生物合成的经典途径始于 RNAPII 的转录，产生长的初级转录本（pri-miRNAs）。
2. pri-miRNAs 通过两种 RNase III 型酶 Drosha 和 Dicer 依次加工成熟 miRNAs。
3. miRNA 基因的启动子与编码基因的启动子具有共同特征，使得它们能够对发育、生理和病理信号作出复杂的转录调控。
4. 人类 miRNA 位点位于外显子和内含子区域，通常以簇的形式组织，形成包含多个 miRNA 发夹结构的"多顺反子"转录本。

• 图3. 小RNA和长非编码RNA的生物发生（A）miRNAs的明确定义的生物发生途径。在经典途径中，RNA聚合酶II合成pri-miRNAs，由Drosha和Dgcr8组成的Microprocessor复合体切割，释放pre-miRNAs。Pre-miRNAs通过Xpo5导出并在细胞质中被Dicer切割。这种处理产生miRNA双链，这些双链加载到Ago上，Ago选择一条链（引导链）形成RISC复合体，丢弃另一条链（乘客链）。根据末端序列和结构，可以选择5′或3′链。有几个非常规途径，绕过Drosha或Dicer。从去分支内含子形成的mirtrons，直接由RNA聚合酶II转录产生的5′端加帽pre-miRNAs，snoRNA ACA45，和异亮氨酸tRNA绕过了Drosha处理。对于5′端加帽pre-miRNA，3′链被选作引导链。Pre-mir-451由于其短茎而无法被Dicer切割，而是由Ago2在3′链中部切割，并进一步由3′-5′外切核糖核酸酶PARN修剪成成熟形式。
• （B）lncRNAs的多样化生物发生途径和特征。LncRNAs主要通过多种加工策略从RNA聚合酶II（RNAPII）转录的RNA前体产生。大多数lncRNAs被认为是mRNA样，它们在核内通过剪接、5′端m7G加帽和3′端多聚腺苷酸化进行类似的mRNA加工，随后通过核孔复合体导出。已揭示导出的mRNA样lncRNAs具有不同的功能，通过调节翻译、诱骗蛋白质或miRNAs以及调节细胞质细胞器的结构和功能。虽然未在图中显示，但核保留的lncRNAs有额外的机制确保其核定位。一些其他lncRNAs通过非常规途径加工，导致独特的格式，通常保留在核内。例如，NEAT1和MALAT1具有3′端三螺旋结构，这些结构从单个外显子转录本通过RNase P修剪而成，SPAs和sno-lncRNAs从多顺反子转录本加工而成，并通过5′端或两端的snoRNA-蛋白复合体（snoRNP）稳定。值得注意的是，核保留的lncRNAs被发现调节染色质重塑、转录、核凝聚物的组装和功能，并作为蛋白质或RNAs的诱饵。关于来自RNAPII转录RNA前体的环状RNA的生物发生已在其他地方讨论。

Para_01

1. 初级 miRNA（pri-miRNA）形成具有不完美茎结构（通常约 35 bp）、末端环（优选≥11 个核苷酸）和侧翼单链 RNA（ssRNA）段（优选≥9 个核苷酸）的局部发夹结构。
2. 除了这些结构特征外，初级 miRNA 还常含有序列元素，包括基底连接处的 UG 基序、顶端连接处的 UGUG 基序、茎基部的 mGHG 基序和 bGWG 基序。

Para_02

1. 这些特征被 Drosha 及其共因子 DGCR8（在蠕虫和果蝇中也称为 Pasha）识别，共同形成一个被称为"微处理器"的复合体（图 4A）。
2. 微处理器作为 miRNA 途径的选择性门控。
3. 一个 Drosha 分子和两个 DGCR8 分子通过 Drosha 的 RNase III 域（RIIID）外表面与 DGCR8 的 C 端尾部之间的相互作用构成一个异源三聚体复合体。
4. Drosha 结合到发夹结构的基底侧，而 DGCR8 与 pri-miRNA 的顶端部分相互作用，共同作用作为一个分子尺来测量茎的长度。
5. RNA 结合后，Drosha 发生构象变化，使用 Belt 和 Wedge 区域夹住 RNA 的基底连接处。
6. Drosha 具有两个 RIIID，它们形成一个分子内二聚体，构成一个复合处理中心。
7. 每个 RIIID 在茎的一条链上切割，引入一个特定位置（距离茎基部 11-13 个碱基对）的交错切割。
8. 这种切割释放出一个大约 65 个核苷酸的短发夹，带有 2 个核苷酸的 3' 突出端，称为"pre-miRNA"。

Para_03

1. 在前体 miRNA 产生后，它通过依赖于 Ran 的核转运受体——出口蛋白 5 (Xpo5) 被运输到细胞质中（图 3A）。
2. Xpo5-Ran-GTP 复合物优先结合长度超过 18 bp 的茎和 3' 突出端的 RNA。
3. 因此，前体 miRNA 的 2 nt 3' 突出端提高了与 Xpo5 的结合亲和力，尽管 Xpo5 可以容纳各种 3' 末端结构。
4. 在出口过程中，Ran GTP 酶被激活，水解 GTP 并触发复合物解体，释放前体 miRNA 进入细胞质。

Para_04

1. 在细胞质中，RNase III 酶 Dicer 切除 pre-miRNA 的顶端环（图3A）。
2. Dicer 在真核生物中广泛保守，与 Drosha 具有结构相似性，这表明 Drosha 可能是从古老的 Dicer 进化而来的。
3. Dicer 倾向于结合一个约 22 bp 的茎和 2 个核苷酸 3' 突出端的发夹状 RNA（图4A）。
4. Dicer 通过其平台域和 PAZ 域分别抓住 5' 和 3' 端来识别 pre-miRNA，同时 Dicer 的平坦表面与茎相互作用，使其定位以进行切割。
5. 这样，Dicer 可以从 RNA 终端测量一段固定距离（人类 DICER 的情况为 22 个核苷酸）。
6. 切割位点附近的序列（例如，"GYM"基序）和 5' 终端位置（不利于鸟苷）也影响 Dicer 的相互作用。
7. 在大多数物种中，Dicer 拥有多个双链 RNA 结合域（dsRBDs）的共因子，如人类中的转录激活反应元件 RNA 结合蛋白（TRBP）和果蝇中的 Loqs-PB，这些共因子影响 Dicer 蛋白的稳定性、加工效率和切割位点的选择。
8. 虽然一些无脊椎动物和植物拥有多种专门用于特定小 RNA 途径的 Dicer 同源物，并且强烈依赖于它们的共因子，但脊椎动物只有一个 Dicer，它不严重依赖于其共因子。

• 图4. miRNA生物发生和作用的分子基础（A）miRNA途径中的关键因素。这里展示的是人类蛋白质的例子。DROSHA与两个DGCR8副本形成一个称为Microprocessor的异三聚体复合物。DROSHA识别pri-miRNA的基础侧，而DGCR8结合顶端区域。结构模型基于Kwon等人、Partin等人和Jin等人的研究。
• DICER在Platform和PAZ域中有两个基本口袋，分别用于捕获pre-miRNA的5'和3'端。这里显示的是人类DICER的催化状态，其在解旋酶域经历了构象变化。
• AGO2与导向链（成熟miRNA）一起构成RISC。MID和PAZ域分别捕获miRNA的5'和3'端。RISC的结构来自Schirle等人的研究。
• （B）miRNA与其靶标的相互作用。相对于miRNA的5'端，位置2-7对于靶向至关重要，被称为种子区（用蓝色条表示）。位置8的额外碱基配对是有益的。因此，位置2-8被称为种子区域。位于位置1对面的腺苷与Ago相互作用，增强靶标-RISC的相互作用。3'侧（位置13-16）的互补性也可以补充并稳定相互作用。
• （C）RISC的作用机制。（左）miRNA与靶标之间的广泛匹配允许AGO2进行内切核糖核酸酶切割（切割），导致切割片段的快速外切核糖核酸酶降解。（中）miRNA与靶标之间的不完全互补通过TNRC6和CCR4-NOT复合物导致去腺苷酸化，可能还通过DDX6触发的DCP2介导的去帽作用。（右）不完全匹配的靶标也至少通过三种机制受到翻译抑制。TNRC6与DDX6相互作用，后者又与4E-T关联，促进eIF4E和eIF4G的解离。TNRC6还促进细胞质PABP的解离，后者是翻译起始所必需的。在一个不依赖TNRC6的机制中，Ago诱导eIF4A解离。模型基于Iwakawa和Tomari的研究。

Para_04

1. 前体 miRNA 加工产生一个两端都有 2 个核苷酸 3' 突出端的 miRNA 双链，然后该双链被加载到 Ago 上（图 3A）。
2. Ago 蛋白包含四个保守结构域（N、PAZ、MID 和 PIWI）（图 4A）。
3. 热休克蛋白 Hsp70 和 Hsp90 通过诱导和稳定 Ago 的开放构象来帮助加载 miRNA 双链。
4. 在这个步骤中，发生链选择，其中一条链被选作功能性的"引导"链，而另一条链，"乘客"链，则被丢弃。
5. 链选择取决于双链的热力学稳定性和 5' 基的同一性。
6. 热力学不稳定的 5' 端（例如，A-U 配对或错配）更容易被 Ago 的 MID 结构域识别。
7. 此外，MID 结构域偏好 5' 端的尿嘧啶或腺嘌呤，因为鸟嘌呤和胞嘧啶面临电荷排斥。
8. 一旦加载，乘客链就会解旋并移除，留下引导链与 Ago 结合。
9. 引导链的 5' 和 3' 端分别由 MID 和 PAZ 结构域保护。
10. 这个复合物被称为"RNA 诱导的沉默复合物（RISC）"，作为基因沉默的效应器。

Para_05

1. 除了这一经典的生物发生途径外，还有多种非经典的途径可以绕过 Drosha 或 Dicer（图 3A）。
2. Drosha 非依赖型 miRNA 来自剪接内含子（例如，"mirtrons"），带有 5' 甲基鸟苷帽的短发夹状前体（例如，"加帽 pre-miRNA"），或者来源于 snoRNA ACA45 或 tRNA-异亮氨酸。
3. 虽然非经典 miRNA 通常显示低细胞丰度和保守性，这引发了对其功能重要性的质疑，但一些非经典 miRNA 是保守且高度表达的。
4. 一个例子是 miR-320，一种 Drosha 非依赖型 miRNA，作为加帽 pre-miRNA 转录。
5. miR-320 发夹由 exportin 1 导出，而不是 Xpo5，并由 Dicer 处理。
6. 另一个值得注意的例子是 miR-451，一种 Dicer 非依赖型 miRNA，已知在脊椎动物的红细胞生成中发挥作用。
7. pri-mir-451 由 Drosha 处理，但由于发夹异常短，Dicer 无法切割它。
8. 相反，pre-miR-451 直接加载到 AGO2 上，后者利用其内切核糖核酸酶的"切割器"活性来切割 3' 链。
9. 这种部分处理的 miRNA 进一步通过 3' 到 5' 的外切核糖核酸酶 poly(A)-特异性核糖核酸酶（PARN）修剪，产生成熟的 miR-451。

Para_06

1. 成熟的小RNA在RISC复合体中非常稳定，半衰期超过24小时，远长于典型的mRNA和lncRNA。
2. 然而有趣的是，小RNA的半衰期根据小RNA种类和细胞环境的不同，变化幅度超过一个数量级。
3. 这种可变的降解率主要由一种称为"目标导向的小RNA降解（TDMD）"的机制解释。
4. 当一个小RNA与高度互补的目标结合时，Ago蛋白会发生构象变化，允许广泛的碱基配对，并使小RNA的3'端从PAZ域中脱落。
5. 这种构象似乎被Cullin-RING E3泛素连接酶的底物受体Zswim8识别。
6. Ago的多泛素化导致其通过蛋白酶体介导的降解，释放出小RNA，随后小RNA被降解。
7. TDMD的一个著名例子是miR-7-5p（以下简称miR-7）的快速周转，其半衰期为1.7小时，这是由含有miR-7高互补结合位点的lncRNA Cyrano诱导的。
8. TDMD参与了多种生理过程，包括病毒感染、神经功能和胚胎发育。

Para_07

1. miRNA 生物发生受多种因素和机制的调控。
2. 转录控制主要负责大多数 miRNA 的细胞类型特异性表达模式。
3. 与 RNA 聚合酶 II 相关的转录因子和表观遗传调节因子确保了细胞类型/条件特异性的转录控制。
4. 此外，替代性转录起始和替代性剪接可以决定 miRNA 发夹结构是否包含在初级转录本中。

Para_08

1. 转录后调控在 miRNA 通路中也普遍存在。
2. 许多 RNA 结合蛋白（RBPs）已被鉴定为 miRNA 调节因子。
3. 例如，SRSF3 是一个已知的剪接因子，它与 pri-miRNAs 3' 侧翼区域的 CNNC 基序相互作用，促进 Drosha 介导的加工。
4. Lin28 蛋白结合到 let-7 家族成员的顶端环上，干扰 Drosha 和 Dicer 的作用，并诱导寡聚尿苷酸化，从而下调 let-7 的生物发生。
5. 一些调节因子与 miRNAs 在保守的反馈回路中交织在一起。
6. 例如，Lin28 蛋白阻止 let-7 成熟，而反过来，let-7 则沉默 Lin28 mRNA。
7. 这些反馈回路形成了强大的双稳态开关，允许一次表达一个组分，在细胞命运决定中发挥关键作用。

Modifications on miRNAs

miRNAs 的修饰

Para_01

1. 各种 RNA 修饰可以显著影响特定 miRNA 的生物发生和功能。
2. miRNA 途径中最普遍的 RNA 修饰是 RNA 尾部修饰，如非模板尿苷酸化和腺苷酸化。
3. 在人类中，尿苷酸化由两种相关且大部分冗余的末端尿苷转移酶介导，即 TUT4（也称为 ZCCHC11）和 TUT7（ZCCHC6）。
4. 这种修饰主要发生在 pre-miRNA 阶段，根据分子环境的不同，以多种方式影响 Dicer 介导的加工过程。
5. 例如，当 pre-let-7 与 Lin28 结合时，TUT4/7 催化寡尿苷酸化，抑制 pre-let-7 加工，并通过 3′-至-5′ 外切核糖核酸酶 DIS3L2 促进降解。
6. 在没有 Lin28 的情况下，TUT4/7 催化某些具有异常 1-nt 3′ 末端突出的 pre-let-7 家族成员的单尿苷酸化，从而形成 2-nt 末端突出以促进加工。
7. 在 pre-mir-324 中，单尿苷酸化导致 Dicer 切割位点的选择改变，从选择 5′ 链转变为选择 3′ 链。
8. TUT4/7 在不同组织和癌症中的表达存在差异，表明它们在细胞命运决定和肿瘤发生中的作用。

Para_02

1. 腺苷酸化是另一种类型的 miRNA 尾部修饰，通常不常见且无足轻重。
2. 然而，某些 miRNA 会发生显著的腺苷酸化，这有助于其降解。
3. 在人类中，TENT4B（也称为 PAPD5、TUT3 和 GLD4）或 TENT2（也称为 PAPD4、TUT2 和 GLD2）负责这种修饰。
4. 3′-至-5′ 外切核糖核酸酶 PARN 和 USB1 可以去除这些腺苷酸尾巴，从而拯救 miRNA 免于降解。
5. USB1 的突变与伴有中性粒细胞减少症的斑驳性皮炎中的造血功能障碍有关，而抑制 TENT4 可以恢复造血功能，表明腺苷酸化在这种遗传疾病中起作用。

Para_03

1. 腺苷脱氨酶（ADAR）介导的A到I编辑将腺苷转化为肌苷，调节miRNA的成熟和功能。
2. 例如，pri-mir-142的编辑阻止了Drosha介导的加工过程，并促进pri-miRNA的降解，而pre-mir-151的编辑则抑制了Dicer介导的加工。
3. 此外，ADAR在种子区域编辑pri-miR-376a，改变其靶标特异性。

Para_04

1. 各种类型的甲基化也在 miRNA 通路中发挥作用。
2. METTL1 向包括 pri-let-7e 在内的一组特定的 pri-miRNAs 引入 7-甲基鸟苷（m7G），增强它们的加工，可能是通过防止抑制性 G-四链体的形成。
3. RNA 甲基转移酶 BCDIN3D 修改几种 pre-miRNAs，如 pre-mir-145，在 5′ 磷酸基团上引入 O-甲基化，在乳腺癌细胞中负向调节 Dicer 加工。

Para_05

1. 成熟 miRNA 的 5' 磷酸基团的磷酸化或去磷酸化影响它们的 Ago 装载，因为 5' 磷酸基团对于 miRNA 与 Ago 的 MID 结构域结合至关重要。
2. 在正常细胞中，肿瘤抑制 miR-34-5p 以某种方式被去磷酸化。
3. DNA 损伤后，5' 磷酸基团在共济失调毛细血管扩张突变 (ATM) 和 Clp1 依赖的方式下迅速恢复，促进 Ago 装载。

Para_06

1. 最后，活性氧可以诱导 miRNA 的氧化，生成 8-氧鸟嘌呤（o8G）。
2. 在心脏肥大中，miR-1 在种子区域被氧化，通过 o8G 和腺苷之间的碱基配对改变其靶标库。
3. 氧化还观察到在 let-7、miR-122 和 miR-124 的种子区域，并与胶质瘤和肝细胞癌相关，对肿瘤发生有影响。

The diverse pathways of lncRNA biogenesis

lncRNA 生物发生的多样化途径

Para_01

1. 与大多数遵循定义明确的生物发生途径的 miRNAs（图 3A）不同，lncRNAs 是通过不同的途径产生的，导致其加工、形状、定位、稳定性和功能具有特定性（图 3B）。
2. 最初的人类 lncRNAs 的 GENCODE v7 目录包含 9,277 个 lncRNA 基因，产生超过 14,000 条转录本，而人类 GENCODE 数据库的最新 lncRNAs 目录超过了 20,000 个（https://www.gencodegenes.org/human/stats_46.html），并且以细胞/组织特异性的方式表达。

Para_02

1. 经典的基因间区转录长非编码 RNA（或 lincRNA）与 mRNA 具有相同的 RNAPII 转录和 RNA 加工机制。
2. 像 mRNA 一样，这些 lncRNA 具有 5' m7G 帽子和 3' 多聚(A)尾巴，经历剪接和折叠，并且要么保留在细胞核内，要么通过核孔复合体 (NPCs) 输出到细胞质（图 3B）。
3. 此外，lncRNA 基因也大多具有与蛋白质编码基因相似的组蛋白修饰谱型。

Para_03

1. 更详细的研究已经确定了mRNA样lncRNA与mRNA在转录过程和后续处理方面的不同特征，这些特征与其细胞命运和功能紧密相关。
2. 大量的mRNA样lncRNA是从富含抑制性组蛋白修饰的基因区域转录而来，并通过3'磷酸化的RNAPII复合物进行转录。
3. 与mRNA相比，这些lncRNA包含较少的外显子，但单个外显子较大，通常它们携带较弱的内部剪接信号，而3'剪接位点和分支点之间的距离更长。
4. 此外，一些lncRNA序列中存在丰富的U1小核RNA结合位点，并且与染色质相连。
5. 因此，平均而言，mRNA样lncRNA的丰度较低，剪接效率较低，并且滞留在细胞核内，尽管许多lncRNA在其特征上与mRNA非常相似。
6. 此外，许多mRNA样的lncRNA缺乏或表现出较弱的3'末端多聚腺苷酸化。
7. 这类转录本以及那些剪接效率低下的转录本容易受到外切体介导的降解，导致它们的表达水平较低。

Para_04

1. 未来核保留长非编码核糖核蛋白（lncRNP）复合物的组装与未来细胞质mRNP或lncRNP的组装有何不同，这是一个有趣的问题。
2. 最近的研究揭示了lncRNA内的序列元件和核蛋白协同作用，将lncRNA限制在核内。
3. 例如，RNA-DNA三链结构的形成，含有几十个（sno-lncRNA）到几百个核苷酸的内部RNA序列（如MALAT1），或具有富含C的基序，可以将lncRNA限制在核内。
4. 此外，hnRNPU和hnRNPK是已知参与lncRNA核保留的蛋白质，如XIST和MALAT1。
5. 其他hnRNPs和DExD/H盒RNA解旋酶，如DHX15和DDX42，也已被证明促进MALAT1在核内剪接斑点中的定位。
6. 仍需更多的证据来证实其他顺式和反式因子在促进lncRNA核定位中的作用，特别是确定是否存在共同的基序和调节因子以保持不同的lncRNA在核内。

Para_05

1. 核加工后，一些类似于mRNA的长链非编码RNA被出口到细胞质（图3B）。
2. 类似于mRNA，这些重新定位的新转录本可以招募RNA结合蛋白形成核糖核蛋白颗粒，被转录-出口复合体（TREX）许可和识别，并通过NPC的苯丙氨酸-甘氨酸（FG）重复序列由NXF1-NXT1复合体转运。
3. 因此，lncRNA的出口很大程度上依赖于mRNP出口机制，这与pre-miRNA通过Xpo5-Ran-GTP的出口不同。
4. 到达细胞质后，观察到lncRNA定位于特定的细胞器执行功能，或分布于细胞质中。
5. 例如，长链非编码RNA生存相关黑色素瘤特异性致癌ncRNA（SAMMSON）定位于线粒体，调节线粒体的稳态和代谢。
6. 此外，多聚体分析显示，大约一半的细胞质mRNA样lncRNA附着在核糖体上，这可能使它们能够与mRNA竞争核糖体上的mRNA进入位点，从而抑制翻译。
7. 然而，值得注意的是，鉴于所有lncRNA占细胞中多聚腺苷酸化RNA的大约1%，任何单一lncRNA种类干扰整体翻译的潜力应进一步研究。
8. 此外，最近的研究表明，约30%表达较好的mRNA样lncRNA含有小开放阅读框，这些阅读框可被核糖体参与，潜在地翻译成微肽。
9. 除了这些与核糖体结合的lncRNA外，细胞质中的lncRNA还通过不同的模式参与细胞功能。
10. 例如，许多lncRNA包含miRNA或蛋白质的结合位点，从而隔离这些分子，可能调节mRNA稳定性、信号通路和细胞质细胞器的功能（图3B）。
11. 尽管如此，它们的亚细胞定位机制尚未完全理解，不同的lncRNA可能采用不同的机制实现特定的亚细胞定位和功能。

Para_06

1. 有趣的是，细胞质中的类似mRNA的lncRNA在半衰期上没有显示出明显差异，表明其降解机制与mRNA相似。
2. 值得注意的是，mRNA成熟需要在每个外显子-外显子连接处沉积一个外显子连接复合体（EJC），这通常会影响mRNA翻译和无义介导的mRNA降解（NMD）的后续步骤。
3. EJC与上游终止密码子组装的NMD因子之间的相互作用最终可能导致mRNA降解。
4. 尽管理论上EJC会在经历剪接的lncRNA上沉积，但由于其不可翻译的性质，EJC中心调控对lncRNA监控的影响程度是一个引人入胜的问题。
5. 另外，细胞质lncRNP的成分可能与mRNP不同，尽管它们的出口似乎共享相同的途径。

Para_07

1. 除了类似mRNA的长非编码RNA（lncRNAs）外，大约有超过25%的lncRNAs缺乏经典的多聚(A)尾。
2. 这一估计与大约25%的表达基因在培养细胞中的大量转录本中具有少于30个残基的短多聚(A)尾的观点相似。
3. 尽管对短多聚(A)尾对lncRNA转录本的影响知之甚少，但拥有短多聚(A)尾似乎会降低mRNA的翻译效率。
4. 值得注意的是，一些其他的lncRNAs完全缺乏多聚(A)尾或5′ m7G帽子（图3B）。
5. 最著名的例子是MALAT1和NEAT1，它们的3′末端受到三链结构的保护。
6. 这些丰富的lncRNAs分别在核斑点和副核斑点中发挥关键作用。
7. 此外，其他通过非传统方式加工的lncRNAs通过每个末端的独特元素稳定下来。
8. 这包括snoRNA封顶的sno-lncRNAs和SPAs。
9. 这类lncRNAs与罕见人类疾病遗传原因有关，并可以调节RNA聚合酶I的转录和核仁组织，以及控制snoRNP核心蛋白与全球snoRNA水平之间的协调。
10. 此外，来自RNAPII转录内含子和外显子的广泛存在的环状RNA经历了不同的加工途径。
11. 这些非典型的lncRNAs在细胞和病理生理背景下具有不同的亚细胞定位模式，并发挥调控作用（图3B）。

Modifications on lncRNAs

lncRNA 的修饰

Para_01

1. 与 mRNA、miRNA 和管家非编码 RNA 上定义明确的修饰相比，对 lncRNA 上修饰的理解是有限的。
2. 有趣的是，lncRNA 修饰的结果更类似于 mRNA 的命运，而不是 miRNA 的命运，因为功能 miRNA 在单个碱基水平上的改变可以影响它们的加工或改变 miRNA 靶向位点，从而影响功能，而大多数 lncRNA 的作用模式尚未解析到单个碱基水平。
3. 例如，末端 TUT 催化的尿苷酸化在 miRNA 成熟中起着关键作用，而 A 到 I 编辑可以改变 miRNA 加工或靶标识别。

Para_02

1. 涉及长非编码RNA（lncRNAs）最丰富的核苷酸修饰是甲基核苷酸衍生物，包括N6-甲基腺苷（m6A）和5-甲基胞嘧啶（m5C），以及修饰核苷酸，如假尿苷（Ψ）和肌苷（I）。
2. 据估计，平均每种lncRNA含有1.1个m6A，9.3个m5C，1.1个Ψ和3.5个I。

Para_03

1. 像mRNA一样，大多数lncRNA上的m6A修饰是由甲基转移酶样3（METTL3）和甲基转移酶样14（METTL14）组成的异二聚体复合物产生的。
2. METTL3/METTL14复合物与其他因子的相互作用，包括Wilms’肿瘤1相关蛋白（WTAP）、KIAA1429（VIRMA）、HAKAI、RNA结合基序蛋白15（RBM15）和含锌指CCCH结构域蛋白13（ZC3H13），在这个过程中也是必需的。
3. 此外，U6小核RNA m6A甲基转移酶METTL16被发现与MALAT1的3'三重螺旋结构结合，表明其可能对这种lncRNA具有甲基转移酶活性。
4. mRNA m6A修饰的去除需要AlkB结构域家族蛋白FTO和ALKBH5的参与，而它们是否需要用于lncRNA上的去甲基化还需进一步验证。

Para_04

1. m6A修饰通过与读取蛋白（如含有YTH结构域的蛋白）相互作用被识别为功能信号，并参与mRNA的稳定性、输出、剪接和翻译。
2. 它是否涉及lncRNA的处理有待进一步评估，但一些证据表明它也可能调节lncRNA的功能。
3. 例如，METLL3或RBM15（MTase复合体的成分）的耗竭会损害XIST介导的基因沉默，而YTHDC1的丢失会导致X染色体失活缺陷。
4. 此外，YTHDC1对MALAT1上的m6A识别对于维持核斑点的组成及其基因组结合位点至关重要。

Para_05

1. 目前，NSUN2 是已知的唯一针对 mRNAs 和 lncRNAs 的 m5C 甲基转移酶，其底物特异性和细胞功能尚未完全了解。
2. 已有研究表明，NSUN2 催化的 m5C 甲基化通过依赖 ALYREF 的方式促进 mRNA 的输出。
3. 鉴于这种修饰在 lncRNAs 上的丰富性，这一过程可能也与 lncRNA 的输出有关。

Para_06

1. Ψ 和 I 的修饰分别由假尿苷合成酶（PUSs）和 ADARs 催化。
2. 大量研究表明，mRNA 中假尿苷的掺入增加了 RNA 的稳定性，而 mRNA 中肌苷的存在则影响转录本的选择性剪接、稳定性和亚细胞定位。
3. 值得注意的是，肌苷基本上模拟了鸟苷的化学性质；因此，肌苷修饰导致 mRNA 转录物翻译过程中发生 A 到 G 的替换。
4. 鉴于大多数肌苷修饰发生在人类特有的 Alu 元件（一类重复的短分散元件 [SINEs] 逆转座子）中，且 Alu 元件通常嵌入在 lncRNAs 中，这表明 A 到 I 编辑可能影响某些含有 Alu 的 lncRNAs 的亚细胞命运和功能。

Modes of action of small RNAs and lncRNAs

The well-defined modes of action of miRNAs

miRNA 的明确定义的作用模式

Para_01

1. miRNAs 作为转录后抑制因子，主要通过 miRNA 的"种子"（miRNA 的第 2 到 7 个核苷酸）与靶标 mRNA 上相应序列之间的沃森-克里克配对来靶向特定的转录本（图 4A 和 4B）。
2. 然而，有效的靶向通常不仅需要 6 个核苷酸的种子匹配。
3. 在第 8 位的额外配对稳定了这种相互作用，因此这个第 2 到 8 位的区域被称为"扩展种子"或"种子区域"。
4. 具有相同种子区域的 miRNAs（称为种子家族成员或姐妹 miRNAs）共享大多数靶标（图 4B）。
5. miRNA 第 1 位对面存在腺苷进一步增加了沉默效果，因为 Ago 蛋白有一个识别此腺苷的口袋。
6. 具有所有这些特征的 miRNA 结合位点（8 个核苷酸的扩展种子加上第一个 A），那些具有扩展种子（7mer-m8），或者具有 6 个核苷酸种子加上第一个腺苷（7mer-A1）的位点占 miRNA 引起的大部分抑制。
7. 在第 13 至 16 位的额外配对也适度增强了靶标的结合，允许非典型位点如 6-mer，以及种子中存在错配或凸起的位点如果由额外的 3′ 配对补偿，也可以诱导弱抑制。

Para_02

1. miRNA靶位点（也称为miRNA响应元件或MREs）主要位于mRNAs的3'非翻译区，尽管MREs也在5'非翻译区和编码区被发现。
2. 已经开发了计算算法来预测靶标，主要是基于miRNA-靶标配对特性，如种子区域的存在、与miRNA第1位碱基相对的腺苷、第8位的配对以及第13-16位的3'补充配对，同时考虑种子配对的热力学稳定性。
3. 其他参数，如位点保守性、给定3'非翻译区内位点的数量、位点可及性（可能由RNA二级结构和蛋白质结合决定），以及非翻译区和开放阅读框的长度，也可以提高预测性能。
4. 这些算法可用于优先验证潜在靶标的功能研究。
5. 据预测，人类mRNAs在其3'非翻译区内通常有4-5个保守的MREs。

Para_03

1. 结构研究揭示了目标识别的机制细节（图4A和4B）。
2. miRNA-Ago复合体中的种子区域部分预组织用于碱基配对。
3. 初始且关键的碱基配对发生在2-5位，因为来自Ago的L2连接器的一个α螺旋在miRNA的第6和第7个核苷酸之间引入了一个弯折。
4. 在2-5位的初始核化后，这个α螺旋移开，允许碱基配对传播到6-8位，稳定miRNA-目标相互作用。
5. 这一过程进一步受到Ago磷酸化的动态循环控制。
6. CSNK1A1对Ago蛋白的磷酸化干扰目标结合，而ANKRD52和PPP6C的去磷酸化促进目标关联。

Para_04

1. 在目标识别后，miRNAs 可以通过两种不同的模式进行基因沉默，这取决于 miRNA 与其目标之间的互补程度。
2. 一种更古老的方式涉及 Ago 蛋白的"切割"活动（图 4C，上图）。
3. Ago 的 PIWI 域具有类似 RNase H 的折叠结构，一些 Ago 蛋白可以在第 10 和 11 位之间切割目标。
4. 在四种人类 Ago 蛋白（AGO1 至 AGO4）中，AGO2 具有强大的催化活性。
5. 被切割的目标随后由 5' 到 3' 外切核糖核酸酶 XRN1 和 3' 到 5' 外切核糖核酸酶如外泌体降解。
6. 虽然这种切割模式在植物和可能的低等真核生物中经常使用，但在两侧对称动物（包括人类）中很少使用，因为完美匹配的目标很少。
7. 这种切割模式用于 RNAi 技术，通过设计与目标完全互补的合成 siRNAs 来下调特定基因。

Para_05

1. 在动物中，一种更为主要的作用方式涉及去腺苷化和翻译抑制（图 4C，中部和下部面板）。
2. 去腺苷化需要一种称为 TNRC6（也称为 GW182）的特化适配蛋白，该蛋白与 Ago 稳定结合。
3. 人类有三个冗余的旁系同源物（TNRC6A 至 TNRC6C）。
4. TNRC6 招募主要的去腺苷酶 CR4-NOT 和次要的 PAN2-PAN3，导致快速去腺苷化和 mRNA 降解。
5. TNRC6 还通过 CCR4-NOT 复合体的支架成分（CNOT1）诱导翻译起始的抑制，该成分招募 DDX6。
6. DDX6 不仅促进脱帽，还通过招募与翻译起始因子 eIF4G 竞争 eIF4E 的 eIF4E 转运蛋白（4E-T），从而抑制翻译。
7. 此外，TNRC6 促进多聚(A)结合蛋白（PABP）的解离，后者对于翻译起始复合体 eIF4F（由 eIF4F、eIF4G 和 eIF4A 组成）在 5′ 帽上的关联是必需的。
8. 除了这些依赖于 TNRC6 的机制外，还存在一种不依赖于 TNRC6 的机制，其中 Ago 通过从 mRNA 上移除 eIF4A 来介导翻译抑制。
9. 这些机制并非互斥。去腺苷化似乎在大多数细胞类型中对基因沉默作出主要贡献，但在分子和细胞背景下，如早期胚胎中，翻译抑制也可能发挥重要作用。

The diverse and complex modes of action of lncRNAs

lncRNAs 的多样性和复杂的调控机制

Para_01

1. 与 miRNA 作用机制（图 4）相比，由于 lncRNA 的大尺寸、灵活构象和复杂的相互作用伙伴，完全理解 lncRNA 如何发挥其效应仍然是一个挑战。
2. 过去十年的新兴研究表明，lncRNA 可以通过调节、支架作用、伴侣作用和诱饵作用等方式参与细胞过程的所有维度。
3. 在分子水平上，这些机制包括 RNA-蛋白质、RNA-DNA 和 RNA-RNA 相互作用，从而在不同背景下对染色质结构、转录调控、生物分子凝聚体的形成以及蛋白质和其他 RNA 的诱饵产生可测量的影响。
4. 在这里我们仅讨论哺乳动物细胞中具有代表性的 lncRNA-蛋白质相互作用模式。

XIST is the master regulator of XCI by orchestrating its associated proteins

XIST 是通过协调其相关蛋白质来作为 X 染色体失活 (XCI) 的主要调控因子。

Para_01

1. 许多长非编码RNA参与了表观遗传和转录调控。
2. 其中一个研究最深入的例子是XIST，从失活的X染色体（Xi）转录而来。
3. 在雌性哺乳动物胚胎发育的早期阶段，两个X染色体中的一个会被失活，以确保X连锁剂量补偿，这一过程称为XCI。
4. 这一过程由X失活中心（Xic）控制，这是一个基因组区域，对于触发XCI既必要又充分。

Para_02

1. XIST 仅定位于与 XCI 相关的巴尔体，并且对于 XCI 至关重要。
2. XIST 结构高度复杂，进化上保守，人类中的长度约为 17 kb，小鼠中约为 15 kb。
3. 一旦 Xi 被选择，XIST 形成称为 Xist-云的密集焦点，覆盖 Xi，作为招募各种蛋白质因子进行组蛋白修饰、染色质重塑和基因沉默的平台。
4. 超分辨率显微镜显示，在分化细胞中，Xi 上只有大约 50 个衍射限制焦点含有 Xist 分子。
5. 这些有限的 RNA 焦点和相互作用的蛋白质如何能够使分布在 1.67 亿个碱基对上的约 1,000 个基因沉默？
6. 最近的研究通过定量超分辨率显微镜解决了这一基本问题，该技术可以追踪 Xist 和相关蛋白质的动力学和流动性。
7. 有人提出，单个 Xist 焦点可以形成超分子复合物（SMACs），每个复合物包含许多关键沉默蛋白 SPEN 的拷贝。
8. 大多数 Xist 相互作用蛋白在单个 SMAC 内快速结合和解离，产生局部蛋白质梯度，从而使 Xist 中心效应扩展到更广泛的但邻近的染色质区域。

Para_03

1. 基因删除研究揭示，XIST 内的重复序列和结构元素对其招募 Xi 上的调控蛋白的能力至关重要。
2. 例如，XIST 的 A 重复序列（RepA）采用了被转录共抑制因子 SPEN 识别的结构特征，SPEN 介导了促进组蛋白去乙酰化相关的常染色体连锁基因沉默早期步骤的染色质修饰复合物的招募，而 B 重复序列和 C 重复序列则招募 hnRNPK，后者进一步招募多梳抑制复合物 1（PRC1），随后在 Xi 上招募 PRC2（图 5A）。

• 图5. 代表性长非编码RNA的作用模式 (A) 长非编码RNA参与表观遗传和转录调控，例如在X染色体失活（XCI）期间的X染色体失活特异性转录本（XIST）。XIST是从不活跃的X染色体（Xi）转录的高度结构化和进化保守的长非编码RNA。XIST通过协调其相关蛋白质的逐步招募，成为XCI的主要调节因子，确保X连锁剂量补偿。XIST中的重复序列和结构元件对其招募特定蛋白集合的能力至关重要。例如，A重复序列（RepA）被SPEN/HDAC3识别，B重复序列（RepB）和C重复序列（RepC）可以招募hnRNPK/PRC2（见D，右侧）。携带Xist基因缺失的雌性小鼠在胚胎发生过程中表现出严重的生长迟缓和早期致死。
• (B) 长非编码RNA在组织、支架和调节核凝聚物方面发挥重要作用，如核富集的丰富转录本1（NEAT1）所示。NEAT1_2，较大的异构体，对于个别副斑点的组装至关重要，在此过程中，它隔离了数十种副斑点蛋白，形成核心-壳状的球形核体。NEAT1_2的中部区域位于副斑点的中心，其3'端和5'端区域位于外围。NEAT1_2的不同区域与不同的蛋白质伙伴相互作用（见D，中间）。耗尽Neat1导致冷暴露时胚胎发育停滞或死亡。
• (C) 长非编码RNA可以通过诱饵、隔离和护送各种蛋白质伙伴来实现功能，例如由DNA损伤激活的非编码RNA（NORAD）。NORAD作为Pumilio（PUM）蛋白的诱饵，比例超过化学计量比。每个NORAD包含18个PUM识别元件（PREs），以使PUM在NORAD上富集，随后形成相分离的PUM凝聚物（见D，左侧），从而胜过数千个其他PUM结合的转录本。这一模型使NORAD能够竞争性地隔离大量超化学计量比的PUM，防止增强的PUM活性导致异常有丝分裂，从而促进基因组稳定性。缺乏Norad的小鼠由于PUMs的过度激活而导致基因组不稳定，引起类似早衰的多系统退行性表型。
• (D) NORAD、NEAT1_2和XIST具有主要结合基序或形成二级构象，以组装特定蛋白质，这些蛋白质在时空上发挥作用。在各个长非编码RNA中鉴定了特定RBP结合基序和结构元素，它们在招募不同蛋白质集合以执行功能中起关键作用。

Para_03

1. XIST 转录也受到顺式调控邻近 lncRNA 的调节。例如，Jpx、Ftx 和 Xert 促进 XIST 在顺式上的转录，而来自活跃 X 染色体（Xa）的反义转录本 TSIX 阻止 XIST 表达，确保从 Xa 表达 X 连锁基因。
2. 随着 XIST 介导的基因沉默，失活的 X 染色体形成异染色质的巴尔小体，并定位到核仁周围区域。
3. XIST 相互作用组和功能丧失分析表明，核纤层 B 受体（LBR）可能将失活的 X 染色体定向并隔离到核纤层，并重新配置染色体结构。
4. 鉴于对先前研究中的测序数据重新分析得出与 LBR 在 X 染色体失活中的作用相关的不一致结果，仍需更多的分子证据来支持这一模型。
5. 最近，发现由 Xist 组织的核糖核蛋白复合物包含自身抗原成分，以促进女性性别偏向的自身免疫，这表明 Xist 在病理生理学上还有额外的作用。

Para_04

1. 更好地理解 Xist 的构象及其内部的关键模块在 XCI 这些连续步骤中的介导作用，有助于我们了解其在 XCI 期间的多步骤协调。
2. 最近通过选择性 2'-羟基酰化分析的引物延伸（SHAPE）和二甲基硫酸盐（DMS）化学探针技术对 RepA 进行了二级结构映射，并结合 RNA 建模方法，开始揭示了 1.6 kb 小鼠 RepA 的三维模型，该模型与 Xist 的保守 5' 区域重叠，包括 A 和 F 重复序列。
3. 小角度 X 射线散射分析显示，RepA 可以采取多种构象，但在溶液中更倾向于一种结构。
4. 这些努力表明，Xist 的某些区域存在三级结构。这样的三级结构可能是关键模块，通过在 XCI 期间靶向结合 SPEN 和其他蛋白质来促进 XCI 的启动和扩散（图 5A）。因此，最近开发了一种具有药物特性的小型分子 X1 化合物，该化合物在体外和体内特异性地结合 RepA 动机。
5. X1 以女性特有的方式抑制细胞分化和生长，这表明有可能通过小分子化合物破坏严格的 RNA 结构。

NEAT1 is a well-arranged scaffolder in the multifunctional paraspeckle

NEAT1 是多功能副斑点中的一个井然有序的支架蛋白

Para_01

1. 核体（NBs）是动态的巨分子凝聚物，通常由多种类型的 RNA 和蛋白质组成。
2. 不同的长非编码 RNA 已被证明在组织、支架构建和调节这些凝聚物中发挥关键作用。

Para_02

1. 一个显著的例子是 NEAT1，它负责形成核旁斑点。
2. NEAT1 有两种异构体，NEAT1_1 和 NEAT1_2，均由 RNA 聚合酶 II 转录，并且含有单个外显子。
3. 它们通过 RNase P 的替代 3' 末端加工机制处理，产生聚腺苷酸化的短异构体 NEAT1_1（人类中为 3.7 kb，小鼠中为 3.0 kb）和非聚腺苷酸化的长异构体 NEAT1_2（人类中为 23 kb，小鼠中为 20 kb），后者具有 3' 末端三链结构。
4. 对活细胞中 NEAT1 转录的可视化揭示了核旁斑点的共转录组装模型。
5. 在 Neat1 基因敲除的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF 细胞）中，重新引入 Neat1_2 可恢复核旁斑点，揭示了其在核旁斑点从头组装中的关键作用。

Para_03

1. NEAT1_1 完全覆盖了 NEAT1_2 的 5' 端，而后者在其中间区域（8-16.6 kb）招募核心蛋白成分，如 NONO、富含脯氨酸/谷氨酰胺的剪接因子（SFPQ）和融合于肉瘤中的蛋白质（FUS），作为高度有序的核旁斑点的支架。
2. NEAT1_1 的 5' 端和 NEAT1_2 的两端位于外层壳中（图 5B）。
3. NEAT1 通过其支架化的蛋白质和核旁斑点的完整性在基因调控中发挥多种作用。
4. 例如，NEAT1 可以通过隔离 SFPQ 蛋白质来防止其与这些基因的启动子结合，从而调节免疫相关基因的转录。
5. NEAT1 的缺失导致含有反向重复序列（IRs）的 mRNAs 在其 3' 非翻译区（UTRs）中的去隔离，主要是由于 NEAT1 支架化蛋白的解体，如直接与这些 mRNAs 相互作用的 NONO。
6. NEAT1 的两种异构体通过受调控的异构体多聚腺苷酸化进行动态调控。
7. 由核旁斑点介导的 mRNA 核保留也经历了动态变化，具有昼夜节律，这一过程与线粒体功能交叉调控。
8. 在早期哺乳动物发育的胚胎和胚外谱系阶段的建立过程中，Neat1 和 Nono 对组蛋白共激活物相关精氨酸甲基转移酶 1（CARM1）与核旁斑点的关联以及期望的 H3R26 甲基化是必需的。
9. 耗尽 Neat1 或 Nono 打乱了 CARM1 分布，导致因组蛋白 H3R26 甲基化减少而在 16 到 32 细胞阶段的胚胎停滞。
10. 最近发现缺乏 NEAT1 的小鼠对冷暴露敏感，表明它在体内具有功能性。

Para_04

1. 这种大型RNA如何作为支架并与相互作用的RNA结合蛋白协调以实现核旁斑的功能仍然没有完全理解。
2. 最近的研究揭示了几个位于核旁斑壳层的蛋白质，包括SFPQ、HNRNPF和BRG1，有助于将核旁斑与相邻的核斑点分离。
3. NEAT1_2的末端区域决定了这些蛋白质的壳层定位，并且是这一分离过程所必需的。
4. 此外，NEAT1在核旁斑内的高度有序的空间组织表明，其结构可能作为支架来协调核旁斑蛋白质。
5. 一致地，化学探针和计算分析显示，NEAT1_1似乎折叠成四个独立的域，而NEAT1_2的5'和3'端似乎形成了长距离的碱基配对相互作用。
6. 然而，小鼠和人类NEAT1_1的二级结构相当不同，只有几个短的结构相似区域，这表明NEAT1_1的保守作用可能不需要一个广泛保守的RNA二级结构。

Multi-mode interactions between lncRNAs and RBPs

lncRNA与RBP之间的多模式相互作用

Para_01

1. 除了上述涉及X染色体失活启动和维持以及核仁旁斑组装和维持等复杂生物事件的较长lncRNA外，大量的lncRNA实际上具有较为适中的长度，从几百到几千个核苷酸不等。
2. 这些lncRNA的研究更为深入，其作用机制更为明确，已被证明能够诱捕、隔离和引导不同的蛋白质伙伴，或与DNA和其他RNA形成碱基对以发挥功能。

Para_02

1. lncRNA 蛋白质结合的关键基序通常位于 lncRNA 的某些二级或三级构象中，或者仅仅是 lncRNA 的一级序列中。
2. 人类 FOXD3 反义转录本 1 (hFAST) 是一种在人类多能细胞中高表达的 547 个核苷酸的 lncRNA。
3. hFAST 特异性地与 E3 泛素连接酶 β-转导重复蛋白 (β-TrCP) 结合。
4. 这种结合阻止了 β-TrCP 与磷酸化 β-连环蛋白的相互作用，从而防止 β-连环蛋白在降解复合体中的降解，促进 Wnt 信号传导和人类干细胞的多能性。
5. hFAST 倾向于形成五个独立的茎环，使每个 hFAST 成为一个多价的 β-TrCP 结合平台。

Para_03

1. DNA损伤激活的长非编码RNA（NORAD）长度为5,378个核苷酸。
2. 它是一种丰富的长非编码RNA，在每个HCT116细胞中大约有400个拷贝。
3. NORAD通过其重复的PUM识别元件（PREs），特别是PRE7/8，以超化学计量比诱捕Pumilio（PUM）蛋白PUM1和PUM2（图5C）。
4. PUM1/2结合mRNA 3'非翻译区中的特定基序，通常在编码参与细胞周期调节因子的mRNA中。
5. NORAD对PUMs的隔离防止了异常有丝分裂并促进基因组稳定性。
6. 具体来说，每个NORAD包含18个PREs，总共有约7,200个（400 × 18）PUM结合位点，可以隔离细胞中的约15,000个PUM1和约2,000个PUM2。然而，这7,200个NORAD中的PREs似乎仍然无法完全对抗mRNA中总体的130,000至325,000个PREs。
7. 结果表明，PUMs含有大的氨基末端定位的内在无序区域（IDRs），而NORAD驱动PUMs形成相分离的NORAD和PUM体（NP体），提供一个微环境来招募大量PUMs到这些位点。
8. 在这个模型中，已建立的NORAD-PUM簇通过IDRs介导的PUM-PUM相互作用招募额外的PUMs，形成多价的NORAD-PUM相互作用，从而与环境mRNA竞争（图5C）。
9. 在小鼠中删除Norad会导致由于PUMs的过度激活而引起的基因组不稳定性，导致一种显著的多系统退化表型，类似于早衰（图5C）。

Para_04

1. 另一个例子中，SLERT 是一个 697 个核苷酸的长非编码 RNA，并且仅定位于称为致密纤维组分（DFCs）的核仁亚结构域，在那里它与 RNA 解旋酶 DDX21 相互作用。
2. SLERT 促进 DDX21 采用闭合构象，导致形成低聚化和松散的 DDX21 聚集体，覆盖每个 DFC。
3. 这个过程对于维持适当的 DFC 流动性和核仁中 RNA 聚合酶 I 转录活性是必需的。
4. 化学探针分析显示，SLERT 的一个 103 个核苷酸的环区域对于通过类似分子伴侣的机制与其 DDX21 以次化学计量比相互作用是必需的，这导致在存在 SLERT 的情况下 DDX21 的时间依赖性低聚化。

Para_05

1. 在这个阶段，lncRNA研究中的挑战主要源于它们的灵活性和较大的尺寸，范围从几百到超过100,000个核苷酸，这使得很难像对miRNAs那样精确地解析它们的作用模式到单核苷酸分辨率。
2. 一个令人鼓舞的观点是，报道的功能性lncRNAs通常具有与特定相互作用蛋白质清晰结合模式（图5A-5C），通过二级结构模块（图5B和5C）或明确定义的序列基序（图5A）。
3. 这些观察表明，在功能性lncRNPs中存在关键模块，可以模仿定义明确的miRNP复合体的行为（图4A），尽管鉴于lncRNPs的大尺寸，其性质更为复杂和动态。
4. 然而，仍有一些额外的问题有待解决。
5. 这些问题包括lncRNAs的"诱饵"和"隔离"作用模式能在多大程度上导致可测量的表型，以及RNA二级结构的形成在多大程度上决定了特定lncRNA与蛋白质相互作用之间的精细特异性，需要强有力的生物化学支持。
6. 此外，lncRNA及其相互作用蛋白可能以簇状或多元模式作用。
7. 此外，lncRNAs与蛋白质之间这些不同的作用模式确实为lncRNAs（如Xist和NEAT1_2）（图5A和5B）形成时空作用的超复合体奠定了基础。
8. 在这种情况下，lncRNAs内形成关键结构构象或拥有特定RBP结合基序对于与不同蛋白质的功能性结合至关重要（图5D）。
9. 捕捉这样的lncRNP复合物将进一步使未来能够详细解析lncRNA-效应蛋白的相互作用。

Para_06

1. 值得注意的是，lncRNA-DNA 和 lncRNA-RNA 相互作用可以通过调节三链 RNA-DNA 杂合体（称为 R-环）和转录的形成，招募核中的表观遗传标记和染色质活性，以及部分与靶向 mRNA 配对来调节它们在细胞质中的稳定性和翻译。

Crosstalk between small RNAs and lncRNAs

Para_01

1. 由于小 RNA 和长非编码 RNA 在细胞中广泛表达，它们参与了复杂的调控相互作用网络。
2. 这种互作发生在生物合成和功能水平上。

Crosstalks during biogenesis

生物发生过程中的交叉对话

Para_02

1. 一些被注释为长非编码RNA的转录本包含局部发夹结构，这些结构可以被Drosha和Dicer处理，产生成熟的miRNA（图6A，左）。
2. 在这种情况下，长非编码RNA基因作为miRNA的宿主基因。
3. 例如，第一个被发现的长非编码RNA，H19，在其第一个外显子内含有一个发夹结构，该结构产生两个保守的miRNA，miR-675-3p和miR-675-5p。
4. 这两种miRNA在骨骼肌分化过程中被诱导。
5. 携带H19基因1-kb缺失的小鼠，该缺失移除了mir-675位点并显著降低了部分H19片段的水平，显示出肌纤维再生缺陷。
6. 重要的是，引入miR-675-3p和miR-675-5p可以挽救这种缺陷表型，这表明H19在骨骼肌分化中的反式调控作用是由这两个编码在H19内的miRNA介导的。
7. 还有其他例子显示miRNA宿主于长非编码RNA基因内，如DLEU2341中的mir-15/16-1簇；BIC342中的mir-155；linc-MD1343中的mir-133b；以及肝脏特异性长非编码RNA lnc-pri-miR-122中的mir-122。
8. 这些观察引发了有趣的疑问，即这类长非编码RNA是否仅仅作为初级miRNA或作为具有独立功能的真实长非编码RNA，超出miRNA生产之外，以及长非编码RNA和miRNA基因交织到何种程度。
9. 至少，其中一些长非编码RNA可能具有独立的功能，因为它们中有相当一部分逃脱了Drosha处理并在细胞质中积累。

• 图6. 小RNA与lncRNA之间的串扰 (A) 生物发生过程中miRNA和lncRNA之间的串扰。(左) 一些lncRNA包含局部发夹结构，产生miRNA，作为pri-miRNA，例如H19 lncRNA，其发夹产生两个保守的miRNA，miR-675-3p和miR-675-5p。
• (右) 一些lncRNA可能调节miRNA的加工。例如，lncRNA MPRL与pre-miR-483的顶端环区配对，干扰其与DICER的相互作用，导致顺铂诱导的压力下miR-483产量下降。
• (B) miRNA与lncRNA之间的功能串扰。(左) 一些丰富的lncRNA可能通过诱骗miRNA来调节基因表达。值得注意的是，这种miRNA海绵（ceRNA）假说不太可能在生理条件下发生，除非海绵RNA高度丰富，并且含有多个高亲和力、紧密排列的miRNA结合位点（MREs）。因此，所检查的RNA的化学计量比应进行关键评估。
• (右) miRNA、lncRNA Cyrano和环状RNA Cdr1as之间的复杂串扰。Cyrano与miR-7形成碱基对，通过目标导向的miRNA降解（TDMD）触发miR-7降解，保护Cdr1as免受神经元中miR-7介导的破坏。另一个miRNA，miR-671，与Cdr1as结合并诱导Ago2催化的Cdr1as切割。

Para_02

1. 另一种潜在的相互作用模式涉及 lncRNAs 影响 miRNA 加工。
2. 例如，lncRNA NEAT1 与其相关蛋白 SFPQ/PSF 和 NONO 一起，被认为可以富集寄斑内的 Microprocessor 和 pri-miRNAs，从而增强全局 pri-miRNA 加工。
3. 然而，这一模型最近受到挑战，有报道称 SFPQ/PSF 以不依赖于 NEAT1 或寄斑的方式调节 miRNA 水平。
4. 其他 lncRNAs 可能在细胞质中抑制 pre-miRNA 加工。
5. 例如，lncRNA MPRL 包含与 pre-miR-483 的顶端环区互补的序列（图 6A，右）。
6. MPRL 与该区域的结合干扰了 DICER 与 pre-mir-483 的相互作用，从而减少顺铂诱导应激下的 miR-483 产生。

Functional crosstalk between miRNAs and lncRNAs

miRNA和lncRNA之间的功能串扰

Para_02

1. 一些长链非编码 RNA 被认为可以作为 miRNA 海绵（也称为竞争性内源性 RNA 或 ceRNA），通过隔离 miRNA 导致其他 miRNA 靶点的去抑制（图 6B，左侧）。
2. 当海绵 RNA 表达水平较高且含有多个高亲和力的 MRE 且这些 MRE 相互紧密排列时，这种基于竞争的机制可以有效。
3. 然而，定量分析在生理条件下对 ceRNA 假说提出了挑战，因为细胞转录本中存在大量的 MRE，远远超过任何给定 ceRNA 中的 MRE 数量。
4. 因此，单个内源性转录本不太可能显著地将 miRNA 从其他靶 mRNA 上分离出来。
5. 考虑到大多数长链非编码 RNA 表达水平较低，而且早期关于 miRNA 海绵的报道主要基于过表达实验，报告为 ceRNA 的长链非编码 RNA 可能需要谨慎重新评估。

Para_03

1. Cdr1as 是一种在神经元中大量表达的保守环状 RNA，最初被认为通过作为 miR-7 的 ceRNA 起作用，因为它拥有超过七十个 miR-7 结合位点。
2. 然而，在一个敲除了单外显子 Cdr1as 的整个基因组区域的 Cdr1as 敲除小鼠模型中，miR-7 的丰度和活性降低而非增加，这表明 Cdr1as 很可能不是 miR-7 的海绵。
3. 对于 Cdr1as 功能的替代性观点已被提出：Cdr1as 可能保护 miR-7 和/或允许 miR-7 沿神经元过程传递，或者敲除表型可能是由于与 Cdr1as 单个外显子重叠的一个独立的 lncRNA 所致。

Para_04

1. 小鼠遗传学证据表明，miRNAs 和 lncRNAs 之间的相互作用可以非常复杂（图 6B，右侧）。
2. 一种保守的线性 lncRNA，Cyrano，含有一个与 miR-7 高度互补的结合位点，通过 TDMD 机制触发 miR-7 的降解。
3. 相应地，小鼠中 Cyrano 的敲除导致大脑中 miR-7 的强烈积累和 miR-7 靶标 mRNA 的相应减少。
4. Cyrano 的丢失还导致了 Cdr1as 的减少，Cdr1as 不仅包含 miR-7 结合位点，还包含一个与 miR-671 高度互补的位点。
5. miR-671 诱导 Ago2 催化的 Cdr1as 切割，而 miR-7 被认为通过至少两种机制使 Cdr1as 不稳定：直接作用于 Cdr1as 和间接协助 miR-671 指导的切割。
6. 这一调控网络展示了涉及多种 RNA 的复杂相互作用，对神经元功能具有重要作用。

Pathophysiological roles of ncRNAs

Para_01

1. 在动物模型中对 miRNA 通路的关键参与者进行表征，以及对 miRNA 和 lncRNA 的遗传学研究和疾病关联性研究揭示了它们在哺乳动物不同系统中的关键调控作用（图 7）。
2. 然而，解析小 RNA 和 lncRNA 的工具是不同的，它们可检测到的病理生理作用背后的规则也各不相同。

• 图7. 非编码RNA的病理生理作用 一些具有明确病理生理作用的代表性非编码RNA根据其报道的功能被分为六组，涉及发育、神经系统、心血管系统、代谢过程、癌症进展和免疫调节。
• 报告的miRNAs用蓝色列出，lncRNAs用粉色列出。值得注意的是，列出的非编码RNA在进化上是保守的，在动物模型中或至少在患者来源的异种移植研究中具有可测量的效果。
• 许多列出的非编码RNA在多个系统中发挥调控作用，长链非编码RNA通常具有不同的作用模式。

Pathophysiological roles of miRNAs

miRNAs的病理生理作用

Para_01

1. 在人类中，每个 miRNA 家族平均预测控制超过 400 个保守靶标，通过超过 300 个保守的 7 或 8 位靶标位点（如果包括 6 位位点，则超过 500 个位点）。
2. 这表明约 60% 的人类 mRNA 是 miRNA 的保守靶标。
3. 此外，考虑到大量具有适度但显著影响的靶标位点，似乎绝大多数转录组都受到 miRNA 的影响。
4. 虽然每个位点的抑制作用通常小于 20%，但 miRNA 与编码基因之间的这种密集网络增加了基因表达的稳健性和适应性。
5. 虽然转录控制设定了初始的 mRNA 池，miRNA 则微调转录组，塑造发育过程中复杂且稳健的基因表达模式。
6. 鉴于 miRNA 功能可能涉及每一种发育和生理过程的广泛范围，不难理解 miRNA 水平的变化与人类疾病表型相关，而 miRNA 调控的扰动通常会导致动物模型中的病理缺陷。

Para_02

1. miRNAs 可以以多种方式失调。首先，miRNA 基因中的突变可以严重影响 miRNA 水平和/或它们的靶向特异性。
2. miRNA 基因的缺失或扩增在许多癌症类型中已有记录。
3. 一个典型的例子是人类染色体 13q14 上的 DLEU2 位点的缺失，这与慢性淋巴细胞白血病 (CLL) 和前列腺癌密切相关。
4. 在 DLEU2 的内含子区域发现了一个包含两个 miRNAs (miR-15a 和 16-1) 的簇，这两个 miRNA 基因的小缺失导致了小鼠 B 细胞增殖和恶性肿瘤的发生。
5. 此外，在人 CLL 患者以及自然发生的新西兰黑鼠品系（该品系发展出类似 CLL 的疾病）中发现了降低 pri-mir-16-1 加工效率的点突变。
6. miR-15a 和 miR-16-1 属于同一种子家族，抑制如 Bcl2 这样的致癌基因。
7. 另一个在 B 细胞淋巴瘤及许多其他癌症类型中频繁扩增的位点位于染色体 13q31-q32 上。
8. 后来发现这个位点包含一个产生六个 miRNAs (miR-17, miR-18, miR-19, miR-20, 和 miR-92) 的致癌 miRNA 簇，这些 miRNAs 靶向如 E2F1, p21, 和 PTEN 这样的肿瘤抑制基因。
9. 在患有费宁戈尔德综合征 2 型的患者中发现了该位点的缺失，这是一种常染色体显性疾病，表现为小头畸形、身材矮小和短指症。
10. 单核苷酸变异也可以影响 miRNA 水平：在乳腺癌和胃癌患者中发现的 pri-mir-30c-1 顶端环中的多态性通过改变 RNA 结构和增强 SRSF3 结合来促进加工。
11. 第一个与孟德尔遗传人类疾病相关的 miRNA 是 miR-96。mir-96 种子区的点突变导致非综合征型进行性听力损失 DFNA50 (常染色体显性耳聋-50)。
12. 已提出针对种子序列进行靶向基因编辑作为治疗 mir-96 突变患者的潜在方法。

Para_03

1. 3′ UTR 中的遗传变异可以影响 miRNA 的靶向。
2. SLITRK1 基因中的序列变异，破坏了 miR-189 的靶向，与抽动障碍（Tourette’s 综合征）相关，这是一种表现为抽搐的神经精神疾病。
3. AGTR1 3′ UTR 中的 miR-155 靶点显示出与高血压相关的多态性。
4. 另一个有趣的例子是在特塞尔羊中发现的，这是一种以其异常发达的肌肉质量而闻名的天然品种。
5. 事实证明，特塞尔羊的 myostatin 基因 3′ UTR 中有一个特定的序列变异，该变异创建了一个 miR-1/206 家族的靶点。
6. miR-1/206 在骨骼肌中大量表达，抑制 myostatin 并导致肌肉肥大。

Para_04

1. 除了 miRNA 及其靶点中的突变外，生物发生因子的改变可能导致异常的 miRNA 调控，从而导致病理状态。
2. miRNA 与转录基因调控网络紧密相连，许多 miRNA 受已知具有致癌或抑癌功能的转录因子的控制。
3. 例如，p53 激活包括 miR-34 和 miR-29 家族成员在内的抑癌 miRNA，而 c-Myc 诱导如 miR-17/106 家族成员等致癌 miRNA。
4. 转录后调控也起作用，一个显著的例子是 let-7 被 Lin28 抑制，而 miR-34 被 ATM 和 Clp1 激活。

Para_05

1. 此外，Drosha 和 Dicer 等加工因子中的基因突变可能影响广泛的 miRNAs。
2. 在 Dicer1 综合征患者中，已描述了许多导致 DICER 活性部分缺陷的突变。
3. 热点位于催化残基，但前体 miRNA 相互作用的 PAZ 和平台域等其他重要部分的突变也会影响 Dicer 的活性。

Pathophysiological roles of lncRNAs

lncRNA的病理生理作用

Para_01

1. 与定义明确的 miRNA 通路相比，缺乏参与 lncRNA 加工的一般因素使得很难理解 lncRNA 在体内和疾病发生过程中的群体效应。
2. 然而，与 lncRNA 多样化的分子机制一致，许多证据表明 lncRNA 在病理生理背景下具有调节作用，包括发育、代谢以及神经、心血管、癌症和免疫系统（图 7）。

Para_02

1. 已经报告了单独缺乏 Xist、Norad、Pair 和 Neat1（小鼠中的 Menβ）的动物的可测量表型，包括发育缺陷、早衰和代谢失调（图 7），它们具有不同的作用模式（图 5）。
2. 了解 lncRNA 的体内功能花费了时间和巨大的实验室努力。
3. 例如，早期的遗传学研究建议，在正常实验室条件下，敲除 Malat1 或 Neat1 的小鼠没有表现出明显的表型。
4. 后来，有报道称 Malat1 与内皮细胞功能和血管生长有关。
5. NEAT1 在一小部分小鼠中对于黄体形成和妊娠的建立是必需的，而 Neat1 耗竭导致胚胎停滞。
6. 此外，缺乏 NEAT1 的小鼠由于褐色脂肪细胞分化受损而对冷暴露敏感，其分子机制尚不清楚。
7. 这些观察结果引发了当前动物护理条件可能在多大程度上限制我们对 lncRNA 在现实世界中病理生理作用的理解的担忧。

Para_03

1. lncRNA保守性的复杂性（图2C和2D）以及从它们的转录活性位点中区分lncRNAs效应的挑战，使得在动物中进行lncRNAs的表型研究变得困难。
2. 系统性的基因敲除研究生成了lncRNA敲除小鼠品系，在这些品系中，lncRNA位点保持转录活性，这允许在体内研究lncRNAs的功能相关性。
3. 这类研究的努力确定了五个缺乏Fendrr、Peril、Mdgt、Brn1b或Pint的突变小鼠品系，这些品系表现出围产期和出生后致死或生长缺陷表型，揭示了这些lncRNAs对生命和发育是必需的。
4. 这些lncRNAs如何发挥调节作用，最终导致可观察到的表型，在很大程度上仍不清楚。
5. 基于CRISPR技术的方法加速了lncRNAs的表型研究，至少在细胞和异种移植模型中是如此。
6. 开发了与转录因子融合的催化失活CRISPR-Cas系统，以避免大片段删除，包括用于lncRNA基因抑制(CRISPRi)和激活(CRISPRa)的测定方法，使得在不破坏感兴趣的lncRNA基因位点的大片段的情况下，改变lncRNA表达成为可能。
7. 此外，最近开发的基于CRISPR-Cas13的RNA耗竭方法提供了另一种策略来探索胚胎发生过程中lncRNA的功能。

Para_04

1. 尽管为了功能研究而删除了 lncRNAs 的基因，但细胞水平上越来越多的基因敲除工具表明，在免疫系统（即从先天性和适应性免疫到炎症）的调节中存在许多潜在的功能性 lncRNAs，以及在肿瘤发生过程中（即从增殖和生存的内在能力，通过增强代谢，到肿瘤微环境）也是如此。
2. 此外，许多参与肿瘤发生的 lncRNAs 可以在如 Lnc2Cancer 或癌症 lncRNA 普查等数据库中找到。
3. 这类 lncRNAs 通常表现为非保守性。一方面，这给未来的遗传学研究带来了挑战；另一方面，它们在不同环境中的独特调控与组织特异性和细胞特异性表达模式一致，突显了基于特定 lncRNAs 表达和作用方式的精准医疗的未来潜力。
4. 例如，PCA3 已经被美国食品药品监督管理局（FDA）批准作为 lncRNA 生物标志物，并用于前列腺癌的诊断。

Para_05

1. 一个重要的概念是长链非编码 RNA (lncRNAs) 的表达失调与遗传疾病有关。
2. 例如，D4Z4 结合元件转录本 (DBE-T) 是一种仅存在于面肩肱型肌营养不良症 (FSHD) 患者中的染色质相关 lncRNA。
3. DBE-T 将三胸组蛋白 Ash1L 招募到 FSHD 位点，驱动组蛋白 H3 赖氨酸 36 二甲基化、染色质重塑和 4q35 基因转录。
4. 普拉德-威利综合征 (PWS) 患者的父源性 15q11-q13 缺失包含多个小核仁 lncRNA 和 SPA，而这些小核仁 lncRNA 的缺失可用于 PWS 的早期诊断。
5. 最近的一项研究表明，保守的 lncRNA CHASEER 单倍体不足会导致严重的神经发育障碍。
6. CHASEER 位于染色质结构域螺旋酶 DNA 结合蛋白 2 (CHD2) 的上游，且 CHASEER 单倍体不足导致 CHD2 表达上调，从而促进神经发育障碍的发展。

Para_06

1. 重要的是，理解与长链非编码 RNA（lncRNA）相关的遗传疾病原因，可能会导致具有临床进展的新干预措施。
2. 例如，Angelman 综合征是一种神经发育障碍，由母系遗传的泛素蛋白连接酶 E3A (UBE3A) 基因缺陷引起。
3. 父系 UBE3A 基因由 UBE3A 反义转录本 (UBE3A-AS) 印记，重新激活父系 UBE3A 被认为是治疗 Angelman 综合征的一种潜在方法。
4. 针对并抑制 UBE3A-AS 转录的 GapmeR ASOs 确实导致了父系 UBE3A 的重新激活，并且最近宣布了一项成功的二期研究。
5. 然而，尽管适用于 lncRNA 研究的适当动物模型仍然有限，人类遗传学中的这些证据已经明确地将失调的 lncRNAs 与人类疾病联系起来，并指出了疾病未来治疗的新方向。

Perspectives

Para_01

1. 过去三十年见证了多种非编码RNA类别的爆发性发现（图1），每种非编码RNA都具有独特的进化特征、不同的生物发生机制、特定的长度、结构和亚细胞定位（图2和3），导致它们具有特定的分子功能（图4、5和6）和生理作用（图7）。
2. 小RNA的研究早于长非编码RNA，因为小RNA具有更高的保守性和丰度。
3. 相比之下，长非编码RNA由于通常表达量低、动态折叠和序列保守性低而呈现出更多的复杂性。
4. 虽然miRNA通过相对统一的生化途径发挥作用，但长非编码RNA利用更多样化的机制，很少汇聚到共享的途径上，这使得它们的功能解析更加复杂。

Para_02

1. 最近的技术进步将非编码RNA生物学的理解带入了一个新时代。
2. 诸如修饰的RNA探针、荧光RNA适配体和CRISPR-Cas系统等创新技术，结合超分辨率显微镜，现在能够动态可视化大量长链非编码RNA，揭示了以RNA为中心的亚细胞结构和生物过程。
3. 单细胞RNA测序和空间转录组测序使得能够在原生组织和分子背景下全面分析mRNA和ncRNA。
4. 先进的RNA富集方法和长读长测序促进了新型ncRNA的发现，揭示了额外的隐秘遗传信息。
5. 基于人工智能（AI）的计算建模，结合冷冻电子显微镜（冷冻电镜）和核磁共振等其他方法，现在有助于理解ncRNA的进化、三维结构和功能。
6. 通过这些努力，长链非编码RNA在病理生理学中的作用越来越受到重视，其中许多显示出与人类疾病紧密相关的独特表达模式和调控作用，有些已被确认为生物标志物或治疗靶点。
7. 鉴于长链非编码RNA的非保守性质，需要更多的动物模型和人类类器官模型进行表型研究，特别是它们对病理生理刺激的反应，如化疗和免疫疗法。
8. 事实上，已经使用人类大脑类器官模型鉴定了胶质瘤中的治疗性长链非编码RNA靶点。

Para_03

1. 已经开发了基于小 RNA 的药物来治疗疾病，利用其明确的作用机制（图 3 和 4）。
2. 自从 FDA 批准首个 siRNA 药物 Partisiran 以来，该药物靶向转甲状腺素蛋白 mRNA，另外四种 siRNA 药物也已上市，用于治疗神经系统、心血管系统和肝脏系统的疾病。
3. 化学修饰和递送技术的进步极大地提高了 siRNA 药物的疗效和药代动力学，使其成为一种极具前景的治疗模式，特别是对于以前认为难以药物化的靶点。
4. 接下来的挑战包括提高对难以到达的组织（如实体瘤和免疫细胞）的递送效率，以及扩展给药途径，例如口服给药。
5. 实现细胞类型特异性递送也是一个关键目标。
6. 预计通过进一步改进 siRNA 设计、化学修饰和递送技术可以克服这些限制。
7. 使用 miRNA 模拟物和 miRNA 抑制剂进行治疗也将是一个有趣的方向。

Para_04

1. 基于 lncRNA 的模式（无论是作为疾病相关靶点还是作为感兴趣的 lncRNA 功能模块的适配体模拟物）的发展，在很大程度上落后于其他领域，因为它们结构不稳定、易受 RNase 影响且具有免疫原性。
2. 然而，lncRNA 通常包含多个结构元素，可以指导其与特定蛋白质、DNA 和 RNA 的功能性相互作用，为多样化的治疗应用提供了机会。
3. 在解析 lncRNA 功能（图 5A-5C）和结构（图 5D）方面仍存在挑战。
4. 未来的工作需要揭示 lncRNA 的加工和折叠规则，这可能有助于开发针对疾病相关 lncRNA 的新治疗模式。
5. 例如，已经开发了寡核苷酸来调节 lncRNA 在病理生理过程中的表达。
6. 例如，GapmeR ASO 已被用于改变疾病相关 lncRNA 的转录。
7. 据报道，小分子可破坏 Xist 的功能结构域，从而干扰 XCI 过程。
8. 此外，还开发了 lncRNA HULC 的结构模拟物，以干扰 PAH 的活性，从而维持肝脏的代谢稳态。
9. 对 lncRNA 结构的更好理解可能会提供通过靶向疾病或组织特异性 lncRNA 开发下一代药物的机会。

Para_05

1. 化学修饰影响 RNA 的加工、活性和稳定性。
2. 尽管迄今为止已经描述了超过 100 种类型的 RNA 修饰，但大多数修饰被认为在 miRNAs 和 lncRNAs 中很少见。
3. 除了 RNA 上的天然化学修饰外，一种可编程策略将生物非活性 RNA 结合化学化合物转化为生物活性降解剂，如 RNase L，并通过结合小分子成功靶向结构化的 RNA 区域进行降解。
4. 进一步开发基于化学的热稳定性和光稳定性探针用于 RNA 标记，定向设计异核苷酸，以及提高化学合成核酸的半衰期，将有助于更好地理解基本的 ncRNA 生物学，同时提供新的治疗策略。

Para_06

1. 尽管如此，关于小 RNA 和长非编码 RNA 的令人兴奋的发现将持续不断。
2. 这些发现不仅包括意外的非编码 RNA 类型和修饰的识别，还包括在单分子和高分辨率水平上对其动态加工和周转模式的阐明，以及对其分子机制、病理生理作用及其与微环境相互作用的澄清。
3. 未来的工作，特别是采用前沿的多学科技术进行非编码 RNA 研究，将增强我们对其基本生物学过程的理解，以及它们在疾病治疗中的治疗潜力。

Acknowledgments

Para_01

1. 我们向那些由于字数和引用限制而未能被引用的同事表示歉意。
2. 本综述未讨论细菌、病毒和植物中的非编码RNA。
3. 我们要感谢吴浩、金惠俊、刘楚潇、孙素敏、朴延宇、金海东、李永允和刘小奇在格式化手稿方面的帮助。
4. 我们感谢中国科学院战略重点研究计划（XDB0570000）、中国国家重点研发计划（2021YFA1300501）和上海市科学技术委员会（23DX1900101）对C.-L.L.的支持，以及韩国科学与信息通信技术部基础科学研究所（IBS-R008-D1）对V.N.K.的支持。
5. C.-L.L.还感谢来自探索者奖和新基石科学基金会（NCI202232）的支持。

Declaration of interests

Para_01

1. L.-L.C. 和 V.N.K. 是细胞咨询委员会的成员。