Cell 综述，核糖体结构的出现以及涉及核糖体与其底物 tRNA 之间相互作用的核心过程机制

Basic Information

• 英文标题：The ribosome comes to life
• 中文标题：核糖体焕发生机
• 发表日期：14 November 2024
• 文章类型：Review
• 所属期刊：Cell
• 文章作者：Harry F. Noller
• 文章链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867424012170

Summary

Para_01

1. 核糖体与其 tRNA 底物一起，通过将携带遗传信息的 mRNA 转化为蛋白质，将基因型与表型联系起来。
2. 在过去半个世纪里，核糖体的结构和作用机制从神秘和混乱中逐渐显现出来。
3. 现在很明显，核糖体是一种古老的基于 RNA 的分子机器，具有令人惊叹的结构复杂性，并且在所有生物体中基本相似。
4. 蛋白质合成的三个核心功能——解码、肽键形成的催化以及 mRNA 和 tRNA 的移位——基于从生命的基础大分子 RNA 的特性演变而来的优雅机制。
5. 此外，这三个功能（甚至生命本身）似乎是在对抗熵的情况下进行的。
6. 因此，蛋白质合成似乎利用了 GTP 水解和肽键形成提供的能量来限制发生在核糖体上的事件的方向性和准确性。

Introduction

Para_01

1. 细胞杂志成立于1974年，巧合的是，这一年也是 Firesign Theater 发行专辑《你所知道的一切都是错的》的年份。
2. 人们普遍认为核糖体RNA（rRNA）的作用是为定位核糖体蛋白提供结构支架，而核糖体蛋白被认为是核糖体的功能实体。
3. 甚至有人认为蛋白质合成的基本功能是由翻译因子而不是核糖体本身完成的，后者被广泛认为只是为因子与mRNA和tRNA相互作用提供了一个被动的表面。
4. 当时，我们对核糖体结构及其功能机制的理解可能善意地被描述为两个黑匣子。
5. 尽管如此，一些基本的事情还是正确的。
6. 已经确定mRNA是在小核糖体亚基中读取的，tRNA受体端的结合以及肽键形成的催化发生在大亚基上。
7. 这些发现限制了tRNA（其结构刚刚开始显现）的反密码子和受体端分别朝向小亚基和大亚基的方向。
8. 一些核糖体蛋白已经被正确测序；唯一完整的rRNA序列是120个核苷酸的5S rRNA；但即使是它的二级结构在当时也是有争议的。
9. 我们对核糖体三维结构的感觉才刚刚开始从低分辨率透射电子显微镜（TEM）中浮现出来。

Para_02

1. 自1974年以来的半个世纪里，许多艰巨的实验障碍和一些误导性的范式已经被克服。
2. 随着快速测序方法的发展，我们现在拥有了来自系统发育谱系各物种的大核糖体RNA和蛋白质的完整、准确序列。
3. 最令人惊讶的是该领域创始范式的完全颠倒。
4. 首先，人们认识到核糖体本身执行蛋白质合成的功能，尽管受到翻译因子的协助和调节。
5. 其次，现在明确几乎核糖体的每个功能都是基于其rRNA的。
6. 事实上，目前尚不清楚是否有任何核糖体功能是由核糖体蛋白决定的。

Para_03

1. 核糖体及其亚单位最终被结晶，它们的结构，包括许多功能复合体，通过X射线晶体学得以解析。
2. 冷冻电子显微镜（cryo-EM）技术的出现提供了分辨率不断提高的结构，直接电子探测器的问世现在将冷冻电镜转变为确定非常大分子结构高分辨率的主要方法，最显著的是核糖体。

Para_04

1. 我们今天处于什么位置？
2. 核糖体学家现在正致力于研究核糖体功能的基本分子机制这一具有挑战性的过程。
3. 在理解诸如解码、起始、移位、终止和肽键形成等核心机制方面已取得巨大进展。
4. 最令人兴奋的是意识到核糖体实际上是一种复杂的基于RNA的分子机器，在蛋白质合成过程中经历了许多大规模和小规模的结构重排。
5. 许多这些进步是通过使用1974年还处于起步阶段甚至无法想象的技术实现的。
6. 我们已经从基本上以大肠杆菌为中心的核糖体学转向了一个基本发现往往来自专注于更复杂真核核糖体实验室的世界。
7. 但尽管取得了所有这些进展，仍有许多基本问题尚未得到解答。

Para_05

1. 这篇综述描述了核糖体结构的出现以及涉及核糖体与其底物 tRNA 之间相互作用的核心过程机制。
2. 重点在于解码和移位的机制，这揭示了核糖体的结构动力学如何成为遗传密码翻译及生命本身的可能性的基础。
3. 这里讨论的许多主题都是先前众多优秀综述的主题。

The functional roles of rRNA

Para_01

1. 早在1968年，先知先觉的弗朗西斯·克里克通过一个精心推理的论点得出结论："很容易想象原始核糖体是否可以完全由RNA组成。"
2. 然而，由于普遍的观点是所有细胞功能都是由蛋白质执行的，因此在核糖体中发现了数十种不同蛋白质的发现激发了一场广泛的竞赛，以确定哪些蛋白质负责哪些功能。
3. 这进一步被复杂化，因为首先发现影响大肠杆菌核糖体功能的突变，如抗生素抗性，被映射到核糖体蛋白基因上，而不是rRNA基因。
4. 回顾过去，我们现在理解这只是因为有多个基因编码rRNAs，而大肠杆菌的核糖体蛋白是由单个基因编码的。
5. 尽管如此，从1970年代开始，一系列的发现开始暗示rRNA在核糖体功能中的作用。
6. 用RNA特异性试剂酮肟处理30S核糖体亚单位使其失活。
7. 体外重构产生了令人惊讶的结果，即来自处理亚单位的16S rRNA是失活的目标，而蛋白质仍然完全活跃。
8. 失活归因于tRNA结合活性的丧失，如果亚单位在酮肟处理前与tRNA结合，则可以防止失活。
9. 发现失活是由16S rRNA仅在少数鸟嘌呤上的衍生化引起的。
10. 当通过RNA测序鉴定出酮肟反应位点时，指出其中许多是普遍保守的，这与它们可能是功能重要的观点一致；此外，它们最初对酮肟具有反应性的事实表明，它们不是为了创造蛋白质结合位点而被保守的。

Para_02

1. 一个重大突破是发现未修饰的P位点tRNA的摆动碱基可以几乎定量地与16S rRNA中普遍保守的C1400进行光交联。
2. 附着在肽酰tRNA受体末端的反应基团被发现仅与23S rRNA交联，这表明rRNA可能甚至参与了肽键形成的催化作用。
3. 快速化学探针方法的发展随后导致了A-、P-和E-tRNA结合位点的映射，以及起始因子IF1和IF3以及延伸因子EF-Tu和EF-G在rRNAs上的结合位点的确定。

Para_03

1. 即使是核糖体导向的抗生素也被映射到 rRNA 结合位点。
2. 虽然 mRNA 本身有趣地几乎不与核糖体接触，但实验表明，16S rRNA 3'端附近的一个序列通过与起始密码子上游的互补序列结合，在蛋白质合成的起始中发挥作用的假设是正确的。

Para_04

1. 关于 rRNA 功能作用的结构证据来自于 30S 亚基复合物的晶体结构，该结构揭示了 16S rRNA 中普遍保守的核苷酸与 A 位点密码子-反密码子二聚体之间的接触。
2. 大约在同一时期，70S 核糖体复合物的第一个晶体结构显示，位于两个亚基界面处的核糖体功能中心，包含 mRNA 和 tRNA 结合位点以及催化位点，几乎完全由 RNA 构成。
3. 这些发现不仅开始推翻蛋白质范式，还为核糖体的进化提供了合理的解释。
4. 现在普遍认为，核糖体是从一个所有功能（无论是遗传还是生化）均由 RNA 执行的 RNA 世界中产生的；克里克 1968 年的假设可能是正确的。

Ribosome structure

Para_01

1. 经过多次尝试使用当时的常规 RNA 寡核苷酸测序来确定大 rRNA 的一级结构后，DNA 克隆和测序技术的出现导致了来自大肠杆菌的 16S 和 23S rRNA 基因的测序。
2. 随后，通过比较序列分析使用不同物种之间的补偿碱基变化来确定它们的二级结构，从而建立沃森-克里克碱基配对。

Para_02

1. 早期关于核糖体及其亚基三维结构的图像是通过低分辨率透射电子显微镜（TEM）获得的，通常使用负染色技术。
2. 最终，抗核糖体蛋白抗体的发展使得通过电子显微镜图像中核糖体结合抗体的位置来识别许多核糖体蛋白的位置成为可能。
3. 传统的电子显微镜最终被冷冻电子显微镜（cryo-EM）所取代，后者开始提供分辨率不断提高的图像。

Para_03

1. 一种基于中子衍射的新颖策略用于确定30S亚基中核糖体蛋白的三维位置。
2. 通过体内重构构建的完全氘化的30S颗粒中，1H标记的蛋白质对之间的干扰来确定蛋白质之间的距离。
3. 溶剂使用H2O和D2O的混合物进行对比匹配，从而形成一个中子散射目标，在该目标中，除了1H标记的一对外，所有其他蛋白质都变得不可见。
4. 测量了数十种蛋白质对组合，使得能够组装出包含所有21种蛋白质位置的独特图谱。

Para_04

1. 但是，当几个研究小组开始成功获得适合X射线衍射研究的大型单个核糖体和核糖体亚基晶体，并且分辨率不断提高时，高分辨率核糖体结构的希望最终集中在了X射线晶体学上。
2. 同步辐射源产生的高度聚焦、高强度X射线，以及改进的探测器，克服了从具有非常大晶胞的核糖体晶体中准确收集数百万个反射点以获得高分辨率衍射数据集的许多问题。
3. 然而，确定它们的相位提出了一个艰巨的挑战，尤其是考虑到核糖体结构缺乏对称性。
4. 由于核糖体的巨大尺寸，传统的单重原子衍生物同形置换方法无法简单地解决相位问题。
5. 这一难题通过利用重原子簇和分子置换相结合的方法得以克服，其中分子包络由低分辨率冷冻电镜图像提供。

Para_05

1. 首个全原子模型揭示了30S和50S亚基的巨大rRNA三维折叠的复杂性以及数十种蛋白质-RNA相互作用的细节。
2. 功能完整的70S核糖体复合物的中等分辨率（5.5–7.8 Å）晶体结构揭示了A位、P位和E位tRNA的结合位点，mRNA通过核糖体的路径，以及十几个亚单位桥的结构身份。
3. 与模型tRNA和mRNA片段结合的亚基结构为核糖体的解码机制和肽键形成提供了令人兴奋的见解。
4. 这些结构显示，早期通过生化实验鉴定出的23S rRNA A环和P环中的普遍保守的鸟嘌呤确实与tRNA的普遍保守的CCA末端配对。
5. 在所有情况下，越来越清楚的是，核糖体的功能位点基本上是由RNA构成的。

Para_06

1. 完整的70S核糖体功能复合物的全原子晶体结构开始出现，最终解决了第一个真核生物80S核糖体的高分辨率结构。
2. 正如预期的那样，真核生物核糖体的核心可以与细菌70S核糖体的结构重叠（图1）。
3. rRNA的延伸部分和附加蛋白质主要位于溶剂表面，而亚基界面的功能区域显示出所有核糖体中几乎完全相同的特征的高度集中。
4. 总计，33种核糖体蛋白在生命的三个域中都是保守的。
5. 最近，已经确定了完整的55S哺乳动物线粒体核糖体的高分辨率结构，突显了一个功能性核糖体可以有多么小。

• 图1. 70S和80S核糖体结构的叠加 大肠杆菌70S核糖体的结构与酵母80S核糖体的结构叠加。
• 80S核糖体的40S和60S亚基的分子表面以透明洋红色显示在大肠杆菌30S（青色）和50S（蓝色）亚基之上。

Para_06

1. 直接电子探测器和强大新软件的发展导致了被称为冷冻电镜结构生物学中的"分辨率革命"。
2. 这使得可以确定原子分辨率的冷冻电镜结构，彻底改变了核糖体结构领域。
3. 事实上，核糖体在这一技术发展中所起的核心作用，使一些结构生物学家将核糖体描述为"冷冻电镜的溶菌酶"。
4. 70S核糖体的结构开始以低于2 Å的分辨率出现，并且最近达到了1.55 Å的分辨率。
5. 人类80S核糖体的结构也达到了1.9 Å的分辨率。
6. 这些冷冻电镜技术的显著进步不仅使分辨率大幅提升成为可能，而且还使得仅使用微克量的材料就能在几天内获得高分辨率结构。
7. 此外，虽然结晶过程选择了一个复合物的单一结构状态，冷冻电镜数据包含了初始样品中所有物种的结构，其中许多物种通常由足够数量的颗粒表示，可以确定其高分辨率结构。
8. 因此，不同核糖体复合物的结构数量激增，目前数据库中报告的分辨率低于4 Å的结构总数已超过1,000个。

Decoding: Aminoacyl-tRNA selection

Para_01

1. 核糖体对正确同源 tRNA 的直接识别构成了阐明遗传密码的基础。
2. 关于这一基本机制的结构基础的最初见解来自于 30S 亚基模型解码复合体的高分辨率晶体结构。
3. 设计了一个包含 tRNA 反密码子茎环（ASL）与 30S 亚基 A 位点上的密码子结合的复合体，以模拟同源 tRNA 与其 mRNA 密码子的结合。
4. 其晶体结构揭示了复杂的构象重排，其中普遍保守的 16S rRNA 核苷酸 G530、A1492 和 A1493 在密码子-反密码子双链的小沟中形成了"A-小"相互作用，并与 16S rRNA 体域的大规模"域闭合"耦合。
5. 得出结论认为，域闭合是核糖体识别同源 tRNA 所必需的。
6. 在随后的结构研究中，在与同源或近似同源 tRNA 结晶的核糖体中观察到了相同的域闭合。
7. 当 G-U 配对位于第一个或第二个密码子位置时，解码中心似乎迫使这种配对采取接近标准沃森-克里克配对的几何形状。
8. 因此，核糖体似乎形成一个三维夹具，强制在解码位点进行沃森-克里克配对。
9. 由于只有当不匹配的尿嘧啶形成其烯醇互变异构体时才可能实现这一点，这可能解释了为什么读取遗传密码的错误频率类似于尿嘧啶酮-烯醇互变异构化的平衡常数。
10. 因此，一种基于仅三个核苷酸的优雅的 RNA 机制使核糖体能够克服密码子-反密码子碱基配对固有的低保真度。
11. 不难想象，这样的机制可能在 RNA 世界中出现，以确保 RNA 复制的准确性。

Para_02

1. 尽管核糖体能够在体外非酶促地将氨酰基-tRNA结合到空闲的A位点，但已知在体内将氨酰基-tRNA递送至A位点需要GTP酶因子EF-Tu作为氨酰基-tRNA·EF-Tu·鸟苷三磷酸（GTP）三元复合物。
2. 这一现象的解释来自于一个关于动力学校对机制的提议。
3. 有人认为，通过一个不可逆步骤（GTP水解）分离密码子-反密码子识别的读取和校对步骤，可以提高核糖体A位点解码的固有准确性。
4. 这一提议后来得到了动力学研究的实验支持。
5. 参与该机制的rRNA的可能性被提出，因为GTP酶延伸因子EF-Tu和EF-G对23S rRNA保守的sarcin-ricin环（SRL）中的碱基提供了化学探针保护，而该环的裂解已被证明是致命的。
6. 冷冻电镜结构显示了与核糖体结合的EF-Tu⋅氨酰基-tRNA·GTP三元复合物，表明进入的aa-tRNA在三元复合物中的方向与结合到核糖体A位点的tRNA的方向显著不同；此外，在D茎和反密码子茎的连接处tRNA的反密码子臂出现了显著的弯曲，这使得反密码子能够正常与A位点的密码子配对，而tRNA的其余部分则由EF-Tu以一定角度保持在反密码子茎上。

Para_03

1. 解码位点中的密码子-反密码子配对如何影响 EF-Tu 的 GTP 水解？
2. 在 16S rRNA 中分离出一对易错（ram）突变，表明通过桥 b8 的亚基间通讯参与了翻译准确性。
3. 在 16S rRNA 中发现的 G347U 和 G299A 突变都被证明增加了氨基酰-tRNA 选择的错误频率。
4. 尽管这两个碱基彼此相距较远，但晶体结构显示，这两个突变导致几乎相同的结构重排，破坏了桥 b8，形成了类似于 EF-Tu·GTP 结合状态的状态。
5. 结论是，桥 b8 的不稳定降低了达到 GTP 酶激活状态的能量成本，从而降低了解码的严格性。

Para_04

1. 最近的结构研究进一步揭示了校对机制。
2. 时间分辨冷冻电镜策略使我们能够识别出在EF-Tu·GTP递送氨基酰-tRNA后不少于33种核糖体状态，提供了校对机制的详细结构描述。
3. 解码中心不是在最初识别时锁定同源tRNA，而是在GTP水解前后动态监测密码子-反密码子相互作用。
4. GTP水解导致EF-Tu的G域从50S亚基的SRL上解离，释放EF-Tu脱离tRNA。
5. 然后30S亚基将同源ASL锁定在解码中心，并以一种方式旋转，使tRNA能够绕过50S亚基中的空间障碍，进入50S A位点。
6. 相比之下，解码中心无法锁定近同源tRNA，使得近同源tRNA在GTP水解前后都能解离。

Peptidyl transferase

Para_01

1. 肽基转移酶对严格的蛋白质提取程序的异常抵抗进一步表明 rRNA 参与了肽键形成反应。
2. 这一关键点最终通过 50S 亚基与模仿 A- 和 P-位点 tRNA 接受端的 tRNA 类似物结合的高分辨率晶体结构得以确立。
3. 发现没有任何核糖体蛋白的部分距离催化位点在 18 Å 之内。核糖体是一种核酶！
4. 与许多人的预期相反，试图确定可能在肽键形成的酸碱催化中发挥作用的 rRNA 元素的努力最终是徒劳的；肽基转移酶不涉及任何 rRNA 基团的酸碱催化。
5. 将未催化反应与模型底物化合物和真实的核糖体催化的反应之间的活化参数进行比较是有启示性的。
6. 得出结论认为，由核糖体产生的 2 × 10^7 倍速率增强完全是由降低活化熵实现的。
7. 与大多数蛋白质酶不同，核糖体上的活化焓略低于溶液中的活化焓。
8. 核糖体主要通过在其活性位点定位底物来提高肽键形成的速率，而不是通过传统的化学催化。

Why do we need an E site?

Para_01

1. 氨酰基-tRNA被送到核糖体A位点后，其α-氨基攻击与P位点结合的肽酰基-tRNA的肽酰基团，形成肽键并将肽酰基团延长一个氨基酸残基。
2. 这种最初的双位点蛋白质合成模型受到了E位点发现的挑战，脱酰基tRNA在从核糖体释放前会先结合到E位点。
3. 最初对接受三位点模型的犹豫来自于没有明显需要通过增加一个额外的位点来复杂化事物的需求。
4. 但化学探针实验表明，当脱酰基tRNA结合到核糖体时，确实有一组特定的核苷酸在rRNA中受到保护。

Para_02

1. 当在肽键形成后探测两个 tRNA 的结合状态时，A- 和 P-位点 tRNA 在 30S 亚基的 16S rRNA 上的化学足迹仍然存在，P-位点在 23S rRNA 上的足迹也依然存在；然而，A-位点在 23S rRNA 上的足迹消失了，同时出现了 E-位点的足迹。
2. 由于 23S rRNA 足迹的存在依赖于 tRNA 的 3′ CCA 末端的存在，因此得出结论：A- 和 P-位点 tRNA 的受体末端正在从 50S A 和 P 位点移动到它的 P 和 E 位点，导致 tRNA 结合在两个亚基的不同位点上，这些状态被称为 A/P 和 P/E 混合态。
3. 这些混合态的形成是自发的，不需要 EF-G 的参与。
4. 这些发现解释了 E 位点的存在。
5. 50S E 位点是一个具有严格特异性的结合位点，专门结合 tRNA 的去酰基末端，从而将肽键形成的能量与 tRNA 受体末端在 50S 亚基上的前向移动耦合起来。

Para_03

1. 但是为什么 E 位点特异性地识别去酰基化的 tRNA？
2. 这通过高分辨率晶体结构得到了解释。
3. 与 50S E 位点的结合依赖于去酰基化 tRNA 3' 末端 A76 的核糖 3' 羟基与 23S rRNA 的 C2394 位置的 N3 形成氢键，这个碱基在 E 位点 tRNA 结合时受到二甲基硫酸修饰的保护。
4. 当核糖 76 的 3' 羟基被肽段酯化时，这种相互作用被阻断。

Para_04

1. 已经通过基于结构的分子动力学模拟研究了脱酰基 tRNA 的 3′ CCA 端从 50S P 位点到 E 位点的复杂轨迹在混合状态形成过程中。
2. 这些模拟不仅提出了事件的顺序，还突出了可能影响混合状态形成动力学的原子间相互作用。
3. 它们还确定了过渡期间可能遇到的潜在空间冲突，并得出结论认为单链 3′ CCA 尾部的灵活性对于其到达 E 位点是至关重要的。

Large-scale mechanical movements of the ribosome during translocation

Para_01

1. 从核糖体晶体结构中的 tRNA 在 A、P 和 E 位点的位置来看，很明显，在一次转位过程中，tRNA 的反密码子端、受体端和肘部必须分别移动大约 40、70 和 130 Å 的总距离。
2. 由于这些运动中的每一个都必须非常精确地进行，因此提出了核糖体的动态元素可能参与引导它们的可能性。

Para_02

1. 冷冻电镜技术的发展导致了首次观察到如此大规模的结构重排。
2. 当延伸因子 EF-G 在非水解 GTP 类似物 GDPCP（鸟苷基甲叉二磷酸）存在下与核糖体结合时，从溶剂表面观察，30S 亚基相对于 50S 亚基逆时针旋转约 6°。
3. 作者提出了一种两步‘棘轮’机制的移位过程，该过程始于 EF-G·GTP 结合后的亚基间旋转（也称为 30S 体旋转）和 mRNA 通道的打开，随后在 GTP 水解后 mRNA 和 tRNA 发生移动。

Para_03

1. 随后发现，通过冷冻电镜识别的亚单位旋转状态对应于从化学探针实验推断出的核糖体杂合状态（图2B、3B和3C）。
2. 通过构建两个核糖体亚单位之间带有两组反相关荧光共振能量转移（FRET）对的核糖体，使得在溶液中直接观察亚单位旋转成为可能。
3. 当标记的核糖体与肽基-tRNA结合并用嘌呤霉素反应以在P位点产生去酰化tRNA时，核糖体经历了逆时针亚单位旋转。
4. 用EF-G·GTP处理这些旋转复合物后，则导致亚单位向相反方向旋转。
5. 随后的单分子FRET实验表明，亚单位旋转可以在没有EF-G或GTP的情况下自发发生，波动于正向和反向旋转之间。
6. 因此，即使约800 kDa的30S核糖体亚单位的快速大规模旋转运动也可以完全由热能驱动。

• 图2. tRNA 在转位四个主要状态中的移动 (A) 转位前的经典状态 (A/A 和 P/P tRNA) 7ST6。
• (B) 混合状态 (A/P 和 P/E tRNA) 7SSN。
• (C) 嵌合混合状态 (ap/P 和 pe/E tRNA) 7SS9。
• (D) 转位后的经典状态 (P/P 和 E/E tRNA) 7ST2。

• 图3. 核糖体移位的新兴观点 在移位过程中，tRNA和mRNA的运动与核糖体主要结构重排的协调。
• （A）移位前的经典状态，含有A/A和P/P tRNA。
• （B）含有A/P和P/E tRNA的混合状态。
• （C）含有A/P和P/E tRNA以及结合的EF-G的混合状态。
• （D）含有ap/P和pe/E tRNA以及结合的EF-G的嵌合-混合状态。
• （E）移位后的经典状态，含有P/P和E/E tRNA。

Para_03

1. 尽管肽键形成后 tRNA 的受体端移动被发现是自发发生的，但随后 tRNA 的反密码子端与 mRNA 移动耦合的易位需要 EF-G 的参与。
2. 当检查一个 70S 功能复合物的高分辨率结构时，发现 30S 亚基的头部和主体域之间的空间太窄，不允许 P 位点到 E 位点的反密码子茎通过。
3. 有人提出，这可以通过小亚基头部域在冷冻电镜结构中观察到的那种旋转运动来解决，在这种结构中，真核 80S 核糖体-eEF2 复合物被移位抑制剂索拉林捕获在一个不寻常的头部旋转状态。

Para_04

1. 直接证据表明，30S亚基头部旋转在移位中的作用来自于一个包含EF-G和单个tRNA的70S移位中间体的冷冻电镜结构，该结构是在存在 fusidic acid 的情况下捕获的。
2. 在这个复合物中，30S头部域旋转了约18°，与P位点tRNA反密码子茎移动到一个小亚基头部的P位点元素和主体域E位点元素之间的位置耦合。
3. 由于其受体茎已移动到大亚基的E位点，这种状态被命名为pe/E状态。
4. 随后，确定了一个包含两个tRNA的捕获复合物的冷冻电镜结构，显示除了P/E-tRNA的移动外，A/P tRNA也移动到了一种状态，其中其反密码子位于30S亚基头部的A位点和主体域的P位点之间，而其受体端则位于50S亚基的P位点，导致两个tRNA分别以ap/P和pe/E状态结合。
5. 由于这些状态具有不寻常的亚基内部头-体杂交性质，它们被称为嵌合杂交状态，这一名称来源于同名的神话生物（图2C和3D）。

Para_05

1. 进一步的见解来自于被捕获的嵌合杂交状态复合物的高分辨率晶体结构，在这些结构中，16S和23S rRNA的灵活部分的局部运动似乎将tRNA从A位点传递到P位点。
2. 在没有EF-G的情况下形成的嵌合杂交状态复合物的结构显示，像亚基间旋转一样，30S头部域的旋转也可以自发发生。
3. 此外，该复合物中mRNA滑入-1读码框提供了EF-G在移位过程中防止读码框偏移作用的证据。

Para_06

1. 30S亚基头部的旋转是由16S rRNA中的两个结构铰链实现的，这两个铰链的协调弯曲产生了一种绕轴旋转的运动，该轴大致与16S rRNA的h28螺旋轴（30S亚基的"颈部"）对齐。
2. 50S亚基中也发生了大规模的旋转运动，其中L1茎（23S rRNA的H76螺旋）旋转以保持与去酰化tRNA肘部的接触，当它从P位点移动到E位点时。
3. 有趣的是，这两种旋转运动都集中在A型三向RNA连接处，其支点位于内部富含G-U的区域。

Ordering the dynamic events of translocation

Para_01

1. 为了应对理解转运结构动力学的巨大挑战，开发了许多新颖的生物物理方法。
2. 这些方法包括使用批量和单分子FRET技术、零模波导、光镊，甚至‘fleezers’，后者允许对单个翻译核糖体同时测量力和荧光。
3. 通过测量附着在mRNA 3'末端的吡喃荧光素的淬灭，可以跟踪mRNA在其通道内的移动。
4. 将荧光团连接到tRNA上，可以实现直接测量单个核糖体内tRNA的运动，从而追踪氨基酰-tRNA在选择过程中的运动。
5. 通过体外重组构建带有荧光标记的双标记核糖体，荧光标记连接到不同结构域的核糖体蛋白，使得能够实时跟踪核糖体结构域之间的运动，包括亚单位间的旋转，以及30S头部结构域的正向和反向旋转。
6. 这种方法使得可以测量这些动态事件的速度和时间，从而提出了转运过程中事件序列的假设。

Para_02

1. 从首次展示亚单位旋转的动画开始，关于核糖体结构的新论文开始包含电影，说明核糖体及其配体在结构重排期间的预期运动。
2. 对这种电影可能对应的一系列多帧描述之一来自一项低温电子显微镜研究，该研究通过向含有P位点上的fMet-Val-tRNA的复合物中加入去酰基化的tRNAfMet，并在18°C下于不同时间点取出样品进行冷冻保存来诱导反向转运。
3. 这导致了八个主要类别，当按逆序重新解释时，被分配到五个前转运状态和三个后转运状态。
4. 尽管得到的分辨率相对较低（9-20 Å），但可以推断出反向转运的限速步骤涉及与30S亚单位体和头部运动相关联的tRNA的ASLs的耦合移动，30S亚单位P位点和E位点之间的门变宽，以及核糖体构象的整体变化。
5. 这些动态结构事件在没有EF-G或GTP的情况下发生，强烈支持核糖体作为布朗机器运作的观点，即利用热能产生定向的tRNA运动。

Para_03

1. 最近，三个研究小组使用了多种策略来捕获多个易位中间体和易位前后的状态，并将它们置于有序的路径中。
2. 易位前的复合物由大肠杆菌70S核糖体构建，随后加入EF-G·GTP，并确定了所得结构类别的高分辨率冷冻电镜结构。
3. 他们的结果总结在表S1中。
4. 在Rundlet等人的研究中，单分子FRET结果指导捕获了六个正在易位的核糖体的冷冻电镜结构。
5. 使用链霉素和夫西地酸作为抑制剂来减缓易位的早期阶段。
6. 在另外两项研究中，通过时间分辨收集冷冻电镜数据，可以确定易位事件的顺序，其中易位被充分减缓，以便快速冷冻中间状态。
7. 在Petrychenko等人的研究中，通过添加多胺和抗生素阿普拉霉素以及将反应温度降低到4°C来减缓易位。
8. Carbone等人的时间分辨研究试图避免添加抗生素或非水解GTP类似物可能捕获非路径状态的可能性。
9. 他们的策略是在0°C下进行易位，然后在不同时间点快速冷冻以进行冷冻电镜结构测定。

Para_04

1. 所有三个小组确定了两个 tRNA 以经典 A/A 和 P/P 状态结合的前移位复合物结构，30S 体或头部域几乎没有旋转（图 2A）。
2. 所有三个小组还确定了两种不同的杂交态复合物，这些复合物缺乏 EF-G，体旋转 8°–10°，头旋转 3°–5°；第一类包含 A/P 和 P/E 杂交态的 tRNA，而第二类不同的杂交态显示 A/P tRNA 的肘部向 E 位点移动约 20 Å，形成了所谓的 A/P* 状态（表 S1）。
3. 两个小组报告了几乎相同的含有 EF-G 的 A/P* 杂交态结构。
4. 同样的两个小组获得了包含 tRNA 处于 ap/P 和 pe/E 状态的嵌合杂交态复合物的结构，体旋转约 3°，头旋转 18°。
5. 第三个小组获得了两个额外的中间 EF-G 含有状态（INT1 和 INT2），其旋转值介于杂交态和嵌合杂交态之间，体旋转减少而头旋转增加，分别由链霉菌素和夫西地酸的存在稳定。
6. 最后，两个小组报告了后移位的经典态复合物，其中 tRNA 结合在 P/P 和 E/E 状态，且缺乏结合的 EF-G。

An emergent view of translocation

Para_01

1. 基于这些发现，结合多年的生物化学、生物物理和结构研究，可以设想出70S细菌核糖体（图2和图3）中EF-G催化的易位分子机制的三维动态图景。
2. 肽键形成后，含有位于A/A状态的肽酰-tRNA和位于P/P状态的脱酰基tRNA的经典状态核糖体（图2A）自发重排成一个混合状态（图2B），伴随着约8°–9°的主体旋转和30S头部域约3°的旋转，将tRNA移动到它们的混合A/P和P/E状态。
3. 接下来，A/P tRNA的手肘部分向P位方向移动约20 Å。
4. 然后，EF-G·GTP特异性地结合到核糖体的混合状态构象（图3C），其G域（包含GTP结合位点）与SRL的接触迅速激活GTP水解。
5. 由此产生的复合物保留了其混合状态的旋转，其中EF-G·GDP加上Pi结合的位置几乎与GTP在其GTP结合位点中的γ-磷酸基团位置相同。
6. 在这种初始状态下，EF-G的第4域的顶端接触围绕16S rRNA中普遍保守的螺旋h18构建的复杂三级结构的远端（相对于A位）表面，该结构包含解码位的一个元素G530。

Para_02

1. 接下来，EF-G 触发移位的第一步，从杂合状态转变为嵌合-杂合状态（图 2C）。
2. 这涉及到 30S 头部旋转的显著增加，从约 3° 增加到约 20°，以及 30S 主体旋转的减少，从约 10° 减少到约 3°，同时 EF-G 的第 4 结构域移动到 h18 的近端进入解码位点。

Para_03

1. 这一过渡伴随着解码位点核苷酸 G530、A1492 和 A1493 在密码子-反密码子双链上的三维夹具的破坏，这被认为是移位的限速步骤。
2. 触发机制的具体细节尚不清楚，但可能涉及第 4 域尖端与 h18 结构之间的相互作用。
3. 尽管触发紧随 GTP 水解之后发生，但这两个事件并不一定耦合，因为与非水解类似物或 GTP 酶缺陷突变形式的 EF-G 结合也能触发移位的最初步骤。

Para_04

1. 从A位点释放双链允许mRNA及其两个与其配对的A-和P-tRNA向P和E位点移动。
2. 这是通过30S头部域的旋转来实现的，在头部旋转期间，P-tRNA的ASL仍然精确地与头部结合，通过其ASL茎与16S rRNA头部域的G1338和A1339之间的A-小交互作用稳定（图4A和4B）。
3. A-tRNA的移动与P-tRNA和mRNA的移动耦合，这种耦合由EF-G的第4结构域尖端稳定，该尖端在A-tRNA密码子-反密码子双链体向P位点转运期间保持与次要沟槽接触（图4），防止移码。
4. 在由此产生的头部旋转嵌合杂交状态结构中，A-tRNA现在处于ap/P状态，其ASL结合在30S头部的A位点元素和30S主体的P位点元素之间。
5. 同样，P-tRNA现在以pe/E状态结合（图2C）。

• 图4. EF-G 在移位过程中限制 tRNA 的移动。
• 与 30S A 和 P 位点结合的 tRNA 的反密码子茎环视图，(A) 移位前的经典 A/A 和 P/P 状态，(B) 在 EF-G 存在下部分移位后的嵌合-杂交 ap/P 和 pe/E 状态，以及 (C) 在没有 EF-G 的情况下自发部分移位后的嵌合-杂交 ap/P 和 pe/E 状态。
• 在没有 EF-G 的情况下自发移位时，肽基-tRNA (a/p) 向 P 位点移动得比在 EF-G 催化的移动中更远，直接接触去酰基 tRNA (p/e)。

Para_04

1. 同时，30S亚基的主体域开始逆向旋转，影响了它与EF-G的接触。
2. 在Carbone等人的实时系列研究中，从初始结合状态III到嵌合杂交状态IV再到嵌合杂交状态V，EF-G的第1域与SRL之间的埋藏表面积从960 Ų急剧减少到493 Ų，最后在嵌合杂交状态V中减少到0 Ų，显示出与SRL的接触逐渐丧失。
3. 与此同时，30S主体域的逆向旋转也使保持GDP + Pi在GTP结合位点的开关环元素变得不稳定，导致Pi的释放和EF-G·GDP的解离。
4. 这反过来又允许30S头部域的逆向旋转，该区域不再被EF-G的存在所阻碍，使核糖体回到其经典状态（图2D和3E）。
5. 有趣的是，这表明30S主体域的逆向旋转在某种程度上与Pi的释放有关联。
6. 然而，FRET研究表明，在EF-G结合非水解GTP类似物的情况下，主体域的逆向旋转仍然发生，表明Pi的释放不是30S主体域逆向旋转所必需的。
7. 因此，Pi释放的确切作用在协调核糖体动力学中的作用仍有待确定。

The role of GTP hydrolysis in EF-G-catalyzed translocation

Para_01

1. 尽管在阐明易位机制方面取得了上述进展，但关于延长因子EF-G的GTP水解作用仍存在争议。
2. 主要问题可以概括为：GTP水解的能量是否用于产生一个‘动力冲程’，使tRNA和mRNA通过核糖体移动，或者是在控制一系列基本上自发的动力事件中起作用。
3. 发现即使在没有EF-G的情况下，核糖体易位也可以自发发生，尽管速率大大降低，这表明基本机制必须是核糖体性质的。
4. 此外，开创性的研究表明，与非水解GTP类似物GDPNP（鸟苷基亚磷酰胺）结合的EF-G可以有效地催化一次易位；随后的研究表明，使用GTP酶缺陷型EF-G突变形式阻断GTP水解确实会使易位速率降低约50倍。
5. 然而，即使当GTP水解完全被阻断时，EF-G的结合仍可使易位速率比自发速率提高约10^4倍，这表明易位所需的大部分能量并非由GTP水解提供。

Para_02

1. 最近的一项研究提出，当使用非水解类似物或GTP酶缺陷的EF-G阻断GTP水解时，核糖体的不同旋转运动会发生什么变化？
2. 尽管前向30S头部旋转和反向主体旋转的速度减慢了多达两个数量级，但反向30S头部旋转却无法检测到。
3. 如果GTP水解的能量用于驱动tRNA的移动，那么很难解释为什么阻断GTP水解的影响在它们的移动基本完成的移位点最为严重。
4. 有人提出，GTP水解的主要功能是为一个完整密码子的移位完成提供检查点，从而确保读码框的忠实维持。

Para_03

1. 是否有必要驱动 tRNA 的移动？
2. 室温下自由 tRNA 在水溶液中的扩散系数已被测量为约 60 μ²/s。
3. 这相当于速度约为 70,000 Å/s，或在单个 tRNA 通过核糖体完成一次完整的移位时间（约 50 ms）内移动的距离约为 3,500 Å，tRNA 总共移动的距离约为 150 Å。
4. 换句话说，不需要动力冲程，因为热能本身就能以远高于蛋白质合成观察到的速度驱动 tRNA。
5. 相反，移位机制（核糖体和 EF-G⋅GTP）的作用似乎是限制 tRNA 的移动。
6. 事实上，在没有 EF-G 的情况下，肽基-tRNA 的自发移动距离比 EF-G 催化的移位更远，与脱酰基 tRNA 发生物理接触（图 4）。
7. 因此，EF-G 的作用必须是确保 tRNA 的运动与核糖体的运动精确协调，并防止 EF-G 过早释放。
8. 这两者可能都是为了防止翻译读码框的偏移，这会导致过早终止和潜在有毒多肽产物的合成。
9. GTP 水解的自由能似乎主要用於控制熵事件，这可能包括维持读码框和强制 mRNA 和 tRNA 移动的方向性。
10. 因此，正如肽基转移酶催化（上文讨论）的情况一样，移位的主要问题再次在于克服熵。

Para_04

1. 这一观点与已知的 GTP 酶的一般作用一致。
2. 与 ATP 酶不同，ATP 酶的水解能量通常与力的产生耦合，GTP 酶通常参与关键的调节事件，如真核生物细胞周期中的检查点。
3. 除了 EF-G，还有几种其他 GTP 酶参与蛋白质合成，包括延伸因子 EF-Tu、起始因子 IF2 和释放因子 RF3。
4. 可以认为，在每种情况下，GTP 的水解可能作为检查点，确保翻译过程中每个关键步骤的准确完成。

Ribosomes in cells

Para_01

1. 或许对核糖体如何工作的终极理解将来自于活细胞中核糖体执行蛋白质合成过程的原子分辨率三维电影。
2. 令人惊讶的是，由于冷冻电镜技术的迅速发展，我们现在正接近这一可能性的门槛。

Para_02

1. 在一项研究中，研究人员捕获了细菌肺炎支原体基因组最小化菌株细胞中翻译核糖体的结构，整体分辨率为3.5 Å（图5）。
2. 对未处理细胞的分类导致捕获到13种不同的70S核糖体复合物，分辨率在4.7至9.7 Å之间，它们在构象状态和tRNA及因子组成上有所不同。
3. 这些状态根据先前的时间解析研究被分配到一系列事件中。
4. 随后测试了抗生素治疗的效果。
5. 在用氯霉素处理的细胞中，核糖体几乎完全处于经典的A/A、P/P状态，因为肽基转移酶被阻断了。
6. 在链霉素存在下，核糖体主要被困在A/P、P/E杂合状态下，因为阻止30S头部域的旋转会妨碍杂合态的形成。
7. 最有趣的是假尿苷霉素（PUM）对核糖体的影响，这种抗生素结合到RNA聚合酶上，然后阻断由PUM结合的聚合酶正在转录的mRNA上的翻译过程。
8. 结果是大多数接受PUM处理的核糖体停滞在A/P、P/E杂合状态下，这表明与RNA聚合酶的碰撞可以直接影响翻译核糖体的30S头部域的旋转。
9. 多聚体配置分析显示，肺炎支原体细胞中的两个主要核糖体-核糖体接触（图5）是由相邻30S亚单位之间的接触形成的，这些接触以前在细菌和人类细胞中都已识别出，分别处于相同的"顶-顶"或"顶-背"配置。

• 图5. 细胞内翻译核糖体的冷冻电镜图像 (A) 代表性未经处理的肺炎支原体细胞中核糖体的三维图谱。
• (B–E) 相邻核糖体之间 (B) "顶后" 和 (C) "顶顶" 接触的例子，分别在 (D) 松散和 (E) 紧密多聚体中。(经许可转载自Xue等人)

Para_02

1. 在另一项最近的研究中，使用低温聚焦离子束铣削技术使得通过低温电子断层扫描在人类细胞内对核糖体进行成像成为可能，共识分辨率为 2.19 Å。
2. 分类结果识别出 21 种状态，大多数分辨率在 3 Å 或更好。
3. 发现几种以前未被鉴定为核糖体因子的蛋白质与细胞核糖体结合，并确定了多种抗生素和因子结合位点的高分辨率结构。
4. 很明显，核糖体的结构生物学正在经历一场爆炸性的转变，我们有望从中获得许多令人兴奋的新见解。

Remaining unanswered questions

Para_01

1. 尽管这里描述的发现可能给人一种印象，即我们现在理解了翻译的基本机制，但在经过五十年的研究之后，仍有许多基本问题有待回答。
2. 这里有一些可以想到的例子。

Para_02

1. 在广泛研究的转运领域，术语"棘轮"作为其中一个基础术语出现。
2. 棘轮是一种包含棘爪的旋转机械装置，棘爪在一个方向上啮合，在相反方向上滑动。
3. 在转运过程中，什么是在啮合，什么是在滑动？
4. 是否有一个单独的棘爪同时完成这两项工作？
5. 另一个常用的术语是"锁定"和"解锁"；是上述的棘爪在锁定和解锁，还是有另一个独立的‘锁’在起作用，甚至有多个锁？
6. 在转运过程中，小亚基头部域向前旋转以移动tRNA和mRNA；它是如何向后旋转而不逆转它们的运动？
7. 当EF-G结合时，是什么触发了转运？
8. 为什么EF-G的结构与EF-Tu-氨酰tRNA·GTP三元复合体惊人地相似？
9. 最初的EF-G结构是否在其第4域的位置含有一个RNA？
10. 为什么如此多的核糖体功能与GTP酶耦合？
11. 启动、氨酰tRNA选择和转运之间是否存在某种潜在的共性？

Para_03

1. 随着关于真核核糖体详细信息的激增，我们是否理解了它为什么如此之大？
2. 它的rRNA中的"扩展片段"是做什么用的？
3. 为什么它的rRNA被如此重度修饰？

Para_04

1. 地球上所有生物的小亚基 rRNA 中大约有 140 个普遍保守的碱基，这意味着在漫长的进化过程中，任何一个碱基的突变都是致命的。
2. 尽管经过数十年众多研究人员的巨大努力，我们只能合理解释其中不到 85 个的重要性；另外 55 个碱基起什么作用？
3. 经过这么多年的研究，5S rRNA 起什么作用，为什么它似乎需要保持为大亚基中的一个独立分子？

Para_05

1. 最后，关于核糖体起源的猜想认为它源自RNA世界。为什么？如何发生的？可以想象，从RNA而不是蛋白质进化出一个巨大结构的优势在于它可以逐步进行；由于没有疏水中心，较小的结构可以相互组装而不干扰它们的折叠。遗传密码是如何被选择的？翻译因子最初也是由RNA构成的吗？还有很多值得思考的问题。

Acknowledgments

Para_01

1. 感谢劳拉·兰卡斯特和吉莉安·雷克斯罗德对稿件进行批判性阅读，感谢约翰·保罗·多诺霍提供的专业计算支持，感谢我的实验室成员们的许多有益讨论，以及感谢审稿人的出色评论。
2. 我的实验室研究得到了美国国立卫生研究院资助号 R35-GM118156 的支持。

Declaration of interests

Para_01

1. 作者声明没有竞争利益。

Supplemental information

Para_01

1. 下载：下载 Acrobat PDF 文件（271KB）表 S1。跨位中间体的总结，与图 2 和 3 相关。
2. 为了保持一致性，所有 30S 体 (B) 和头 (H) 域的旋转值均根据欧拉-罗德里格斯方法重新计算，使用 PDB 7K00 作为参考的经典态核糖体（0° B/0° H），因此这些值在细节上将与已发表的值有所不同。