Science｜David Baker团队：利用人工智能从头设计出类天然酶

2025年2月27日，来自华盛顿大学的David Baker团队在Science上发表文章Computational design of serine hydrolases，首次通过计算设计方法成功构建了具有全新折叠类型的高效丝氨酸水解酶。

该研究结合生成式扩散模型RFdiffusion与反应路径预组织评估工具PLACER，突破了传统酶设计在多步反应机制中的瓶颈，开发出催化效率接近天然酶的合成酶。

研究背景与挑战

丝氨酸水解酶是自然界中广泛存在的一类重要酶，通过经典的催化三联体（Ser-His-Asp/Glu）和氧阴离子空穴（oxyanion hole）机制实现酯键水解。其催化循环涉及四步反应：底物结合、酰基化（形成酰基-酶中间体AEI）、水解（水分子攻击AEI）和产物释放。尽管该机制已被深入研究，但人工设计丝氨酸水解酶长期面临三大挑战：

活性位点复杂性：需精确排列催化三联体与氧阴离子空穴，同时维持动态氢键网络。传统方法依赖固定骨架的活性位点移植，难以实现原子级精度。

中间态稳定性：酰基-酶中间体（AEI）的高稳定性常导致催化剂失活，需平衡多步反应的过渡态稳定与中间态解离。

评估不足：现有计算工具难以模拟多步反应中活性位点的动态构象变化，导致设计成功率低。

此前有研究通过简化机制（如使用高活性半胱氨酸替代丝氨酸）或绕过AEI步骤（如金属水解酶设计）取得部分进展，但催化效率（kcat/Km）仍低于10³ M⁻¹s⁻¹，且无法实现天然酶的多步反应机制。本研究提出全新策略：利用生成式模型动态构建活性位点骨架，并通过多态预组织评估优化设计。

研究方法与技术突破

研究团队开发了两项核心技术：

RFdiffusion骨架生成

基于扩散模型的蛋白质生成技术，从最小活性位点描述（催化残基主链构象）出发，通过噪声迭代生成完整骨架。该方法突破了传统固定骨架库的限制，可自由探索非天然折叠空间。例如，针对丝氨酸催化三联体，RFdiffusion生成包含α/β桶、螺旋束等五种全新折叠类型的候选结构。

PLACER反应路径预评估

开发深度神经网络PLACER，模拟催化循环中五个关键状态（apo态、底物结合态、第一四面体中间态TI1、AEI态、第二四面体中间态TI2）的构象分布。通过随机初始化侧链与小分子坐标，生成50次预测的活性位点构象集合，统计关键氢键（如Ser-His、氧阴离子空穴氢键）的形成频率。PLACER在PDB基准测试中达到1.1 Å的平均RMSD精度，显著优于传统分子动力学模拟效率。

技术突破体现于：动态骨架生成，RFdiffusion直接构建适配活性位点的骨架，避免传统RosettaMatch的固定骨架限制；多态预组织筛选：PLACER首次实现多步反应路径的活性位点兼容性评估，筛选出同时满足apo态与AEI态预组织的设计。

图1 设计方法

（A） 利用射频扩散技术生成主动位点特异性骨干网。给定可能的活动位点配置的几何形状，RFdiffusion去噪轨迹会生成支撑位点的骨干坐标。（B） 使用PLACER生成活动站点集合。将所考虑反应步骤中活性位点周围的侧链和任何结合的小分子的坐标随机化，并进行n个样本以生成一组预测。（C） 丝氨酸水解酶水解酯的机理。（D） 用于4MU Ac水解天然丝氨酸水解酶（顶部，PDB：1IVY）和来自第3轮的无活性设计丝氨酸水解酶（底部，josie）的反应坐标沿线不同状态的PLACE集成。

主要研究成果

图2 PLACER集成揭示了催化的几何决定因素

通过三轮迭代设计（Round 1-3）与两轮优化（Round 4-5），研究团队取得以下成果：

高精度酶设计

结构准确性：最佳设计"super"和"win"的晶体结构与模型主链RMSD分别为0.8 Å和0.83 Å，活性位点全原子RMSD低至0.38 Å（图3）。

催化效率提升：最终设计momi120-103对4MU-苯乙酸酯（4MU-PhAc）的kcat/Km达2.2×10⁵ M⁻¹s⁻¹，较初始设计提升近200倍，接近天然枯草杆菌蛋白酶（subtilisin）水平。

图3 设计的丝氨酸水解酶的结构特征

全新折叠类型

设计的五种折叠类型（如momi的α/β桶、win的螺旋束）与天然丝氨酸水解酶（如胰凝乳蛋白酶、乙酰胆碱酯酶）的TM-score均低于0.52，证实其结构新颖性。FoldSeek数据库比对显示，这些折叠与已知蛋白无显著相似性。

机制验证与优化

催化残基必要性：突变催化三联体（Ser/His/Asp）或氧阴离子空穴残基（Thr99）均导致活性丧失>95%（图2E）。

动态构象调控：PLACER分析发现，高效设计在AEI态保持丝氨酸g⁻构象（天然酶特征），而失活设计则转为g⁺构象（图5H-J）。

氧阴离子空穴优化：将Gln71突变为Asn并重构骨架（superfast设计），使kcat提升8倍，证明几何构型对过渡态稳定的关键作用。

应用潜力验证

针对聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）降解需求，重新设计momi120的底物结合口袋，获得对4MU-PhAc的Km低至0.26 μM，催化效率达2.2×10⁵ M⁻¹s⁻¹（图4N），为工程化PET降解酶奠定基础。

总结与未来方向

本研究首次实现了从头设计具有多步反应机制的丝氨酸水解酶，其催化效率（kcat/Km ~10⁵ M⁻¹s⁻¹）较此前设计提升2-5个数量级，且折叠类型突破天然限制。技术突破源于：RFdiffusion的动态骨架生成能力，摆脱传统固定骨架库限制；PLACER的多态预组织评估，解决多步反应路径的活性位点兼容性问题。

未来方向包括：复杂活性位点设计，引入更多氢键网络（如天然酶的第三氧阴离子空穴）以提升催化效率；动态演化优化，结合定向进化技术优化设计酶的构象柔性；应用场景拓展，针对塑料降解（PET酶）、药物合成等需求开发定制化酶催化剂。

该研究为设计复杂多步反应酶提供了通用框架，标志着计算酶设计从单一过渡态优化迈向全反应路径工程的新阶段。

专家点评

伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校合成生物学家赵惠民表示：“这是酶工程领域的里程碑，（它）表明现在可以设计具有类天然活性的酶，使其具备实际应用价值。”

合作研究者邹表示：“这个AI就像'过滤器'，它会检查酶的活性位点（与分子相互作用的部分）是否兼容并正确排列以执行每个反应步骤。”

研究共同作者、西雅图华盛顿大学蛋白质设计师Anna Lauko表示：“这就像去二手店买一套西装，那套西装可能并不完全合身。我们以这种方式设计酶时也会遇到同样的情况。”

Lauko表示：“结合使用这些AI工具帮助实现了'获得完全合身的定制西装'。新设计的酶完整完成了丝氨酸水解的所有四个步骤。这将使我们能够从头设计更复杂的酶，这是以前难以实现的。”

未来，该方法可扩展至其他催化系统（如PET酶、酰胺酶等），并为设计全新反应机制的酶提供框架。通过深度学习工具（如PLACER）对多步反应中间体的建模，能够揭示传统单态分析难以察觉的设计缺陷，从而加速功能酶的理性设计。

参考资料：

https://doi.org/10.1038/d41586-025-00488-3

https://www.science.org/doi/10.1126/science.adu2454

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