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# 单细胞分析

## 研究背景和内容

研究揭示免疫检查点分子TIM-3在小胶质细胞及阿尔茨海默病（AD）中的作用。
全基因组关联研究发现HAVCR2（编码TIM-3）是晚发性AD风险基因且在小胶质细胞中高表达。
研究表明，TGFβ信号诱导小胶质细胞表达TIM-3，TIM-3通过羧基末端尾巴与SMAD2和TGFBR2相互作用，促进TGFBR介导的SMAD2磷酸化，增强TGFβ信号，维持小胶质细胞稳态。
条件性敲除小胶质细胞中Havcr2的小鼠，基因表达谱呈现MGnD特征，吞噬活性增强。
在5×FAD小鼠模型中，小胶质细胞特异性缺失Havcr2可改善认知障碍，减少Aβ病理，Aβ斑块面积在6和7个月时显著降低，斑块表型向低毒性转变。
单细胞测序显示，Havcr2缺陷的5×FAD小鼠存在独特的小胶质细胞亚群，具有促吞噬和抗炎基因表达特征。
该研究表明TIM-3通过TGFβ信号调节小胶质细胞稳态，靶向小胶质细胞TIM-3有望成为AD治疗的新策略。

## 实验设计

此实验共包含 4个单细胞测序样本：
2个对照组（con1_cortex, con2_cortex）即他莫昔芬处理后 Tim3 未被敲除 的基线模型
2个条件敲除组（cKO1_cortex, cKO2_cortex）对应他莫昔芬诱导小胶质细胞特异性敲除Tim3

## 分析方法

1、读取数据并创建Seurat对象

2、质控（去除基因计数 （nFeature_RNA） < 200、UMI 计数 （nCount_RNA） < 1,000 且线粒体基因比例 （percent.mt） ≥ 80%
  的低质量barcode）

3、绘制单细胞图谱

4、根据article_text.txt文章的信息，注释细胞类型

5、对每个细胞类型做差异分析（差异结果绘制火山图）


## 结果

画布为白色，图形尺寸小于画布大小，图注在图形右边。

## 应答语言
中文，图中文字保留原始语言

# 从原始数据重新生成带细胞类型注释的图

library(Seurat)
library(ggplot2)
library(dplyr)

# 设置工作目录
setwd("/mnt/data/home/sunting/repitition/3")

cat("=== 重新生成细胞类型注释图 ===\n")

# 读取原始处理后的数据
combined_seurat <- readRDS("results/combined_seurat_complete.rds")

# 重新添加细胞类型注释
cell_type_mapping <- c(
"0" = "Homeostatic_Microglia",     # 最大聚类，稳态小胶质细胞
"1" = "Activated_Microglia",       # 激活的小胶质细胞
"2" = "MGnD_Microglia",           # 疾病相关小胶质细胞  
"3" = "Microglia_Subtype1",       # 小胶质细胞亚型1
"4" = "Microglia_Subtype2",       # 小胶质细胞亚型2
"5" = "Astrocytes",               # 星形胶质细胞
"6" = "Oligodendrocytes",         # 少突胶质细胞
"7" = "OPC",                      # 少突胶质细胞前体
"8" = "Neurons",                  # 神经元
"9" = "Endothelial",              # 内皮细胞
"10" = "Pericytes",               # 周细胞
"11" = "Other_Cells"              # 其他细胞
)

# 添加细胞类型注释
combined_seurat@meta.data$cell_type <- cell_type_mapping[as.character(combined_seurat@meta.data$seurat_clusters)]

# 验证添加成功
cat("细胞类型统计:\n")
print(table(combined_seurat@meta.data$cell_type))

# 生成按细胞类型分组的UMAP图
p1 <- DimPlot(combined_seurat, reduction = "umap", group.by = "cell_type", 
              label = TRUE, label.size = 3, repel = TRUE) +
  ggtitle("单细胞图谱 - 按细胞类型分组") +
  theme(
    plot.title = element_text(hjust = 0.5, size = 16),
    legend.position = "right",
    panel.background = element_rect(fill = "white"),
    plot.background = element_rect(fill = "white"),
    legend.text = element_text(size = 9)
  )

# 生成按细胞类型和实验组分组的分面图
p2 <- DimPlot(combined_seurat, reduction = "umap", group.by = "cell_type", 
              split.by = "group", label = TRUE, label.size = 2.5, repel = TRUE) +
  ggtitle("单细胞图谱 - 按细胞类型和实验组分组") +
  theme(
    plot.title = element_text(hjust = 0.5, size = 16),
    legend.position = "right",
    panel.background = element_rect(fill = "white"),
    plot.background = element_rect(fill = "white"),
    legend.text = element_text(size = 8)
  )

# 保存图片
ggsave("figures/cell_type_annotation_final.png", p1, width = 14, height = 10, dpi = 300, bg = "white")
ggsave("figures/cell_type_by_group_final.png", p2, width = 18, height = 8, dpi = 300, bg = "white")

# 统计各细胞类型在不同组的分布
celltype_stats <- table(combined_seurat@meta.data$cell_type, combined_seurat@meta.data$group)
write.csv(celltype_stats, "results/celltype_by_group_final.csv")

cat("\n各细胞类型在不同组的分布:\n")
print(celltype_stats)

# 计算各细胞类型比例
celltype_counts <- table(combined_seurat@meta.data$cell_type)
celltype_prop <- prop.table(celltype_counts) * 100

cat("\n各细胞类型比例:\n")
print(round(celltype_prop, 2))

# 创建细胞类型比例的柱状图（更简单）
pie_data <- data.frame(
  cell_type = names(celltype_prop),
  proportion = as.numeric(celltype_prop)
)

p3 <- ggplot(pie_data, aes(x = reorder(cell_type, proportion), y = proportion)) +
  geom_col(fill = "steelblue", alpha = 0.7) +
  coord_flip() +
  ggtitle("细胞类型比例分布") +
  xlab("细胞类型") +
  ylab("比例 (%)") +
  theme(
    plot.title = element_text(hjust = 0.5, size = 16),
    panel.background = element_rect(fill = "white"),
    plot.background = element_rect(fill = "white"),
    axis.text.y = element_text(size = 10)
  ) +
  geom_text(aes(label = paste0(round(proportion, 1), "%")), 
            hjust = -0.1, size = 3)

ggsave("figures/cell_type_proportion_bar.png", p3, width = 12, height = 8, dpi = 300, bg = "white")

# 重新保存带注释的Seurat对象
saveRDS(combined_seurat, "results/combined_seurat_annotated_final.rds")

cat("\n=== 细胞类型注释可视化完成 ===\n")
cat("图片已保存至 figures/ 目录\n")
cat("- cell_type_annotation_final.png: 按细胞类型分组的UMAP图\n")
cat("- cell_type_by_group_final.png: 按细胞类型和实验组分组的分面图\n")
cat("- cell_type_proportion_bar.png: 细胞类型比例柱状图\n")