Cell | 使用 生成式AI 设计 全新抗生素！

在全球抗菌药物耐药性（AMR）危机持续加剧的背景下，世界卫生组织已将其列为全球十大公共卫生威胁之一。据统计，全球每年约有500万人直接或间接死于耐药菌感染，而传统抗生素研发管线持续萎缩——1980-2003年间，全球Top15药企仅开发5种新抗菌药物。在此困境下，2025年10月发表于《Cell》期刊的研究《A generative deep learning approach to de novo antibiotic design》，为生成式深度学习引导的从头抗生素设计提供了平台，为探索未知化学空间提供了可能。

一、研究背景：为何需要AI驱动的从头设计抗生素？

1. 传统抗生素研发的核心困境

传统抗菌药物研发主要依赖“现有化合物库筛选”模式，存在两大致命局限：

• 化学空间覆盖不足：理论上，类药性化学空间约含个化合物，但目前最大虚拟化合物库仅含约个分子，仅能覆盖化学空间的极小部分，难以发现结构新颖的分子；
• 耐药性规避困难：现有筛选依赖已知抗菌骨架，新分子与现有抗生素结构相似度高，易被细菌通过已有耐药机制（如靶点突变、外排泵增强）规避。

此外，淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）等“高危耐药菌”已对多数一线药物产生耐药——淋病奈瑟菌被美国CDC列为“紧急威胁”，亟需结构全新、作用机制独特的抗生素。

2. 生成式AI的技术机遇

生成式深度学习可突破现有化合物库限制，通过学习化学结构与生物活性的关联规律，直接生成符合抗菌活性、成药性要求的全新分子。本研究基于此，构建了“筛选-生成-验证-优化”的全链条AI设计策略。

二、技术框架：双路径生成式设计平台的核心逻辑

研究团队以“精准筛选优质起点+AI定向生成全新分子”为核心，构建了两种互补的设计路径——基于片段设计（Fragment-based Design） 与从头设计（De novo Design），并通过图神经网络（GNN）实现分子活性预测与筛选，形成完整技术闭环（图1）。

1. 基础工具：GNN活性预测模型的构建与验证

作为整个平台的“评分系统”，研究团队首先基于Chemprop框架构建GNN模型，用于预测分子的抗菌活性与细胞毒性：

• 训练数据集：针对淋病奈瑟菌（ATCC 49226），使用38,765个化合物的体外抑菌数据（50μM浓度下的生长抑制率）；针对金黄色葡萄球菌（RN4220），使用39,312个化合物的抑菌数据；同时构建 HepG2、HSkMC、IMR-90三种人源细胞的毒性预测模型，排除细胞毒性分子。
• 模型性能验证：通过三重验证确认可靠性：①活性分子与非活性分子的预测得分存在显著差异（p<0.001）；②预测得分受功能基团影响符合化学规律（如含2,3-二氯苯基的分子得分更高）；③具有物种特异性（对淋病奈瑟菌活性高的分子，对金葡菌活性低，反之亦然）。

2. 路径一：基于片段设计——从 优质片段 到 完整分子

基于片段设计以 化学片段 为起点，通过“筛选-扩展-优化”三步生成抗菌分子，核心逻辑是“片段决定活性，AI优化成药性”：

（1）第一步：4.5亿片段的高通量虚拟筛选

研究团队整合三大片段库，构建含45,858,026个片段的数据库：

• GDB-11库（26,434,571个片段）：含C、N、O、F原子，最多11个原子的稳定片段；
• GDB-13库（1,089,000个片段）：补充含Cl、S原子的11原子片段；
• Enamine REAL库（18,338,026个片段）：具有良好合成可及性的商用片段。

通过GNN模型筛选并施加三重过滤：

1. 活性过滤：GDB库片段预测得分>0.05，Enamine库片段得分>0.1（因后者合成性更好，阈值更高）；
2. 安全性过滤：三种人源细胞毒性预测得分<0.5，且不含PAINS（泛筛选干扰结构）、Brenk（毒性/代谢不稳定结构）；
3. 新颖性过滤：与559种已知抗生素的Tanimoto相似度<0.5（确保结构新颖，规避交叉耐药）。

最终获得1,156,945个针对淋病奈瑟菌的优质片段，以及259,807个针对金葡菌的优质片段。

（2）第二步：AI驱动片段扩展——CReM与F-VAE双模型协同

为将优质片段扩展为完整分子，研究团队采用两种生成模型，形成优势互补：

• CReM（化学合理突变遗传算法）：以片段为种子，通过“原子添加/替换/删除”生成新分子，每次突变均从ChEMBL库的155万个常见结构中采样，确保化学合理性；同时耦合GNN模型，仅保留抗菌活性预测得分>0.7的分子，经过5轮迭代，生成518,203个含目标片段（F1片段 图2）的分子。
• F-VAE（基于片段变分自编码器）：基于ChEMBL的168万个分子预训练，通过“图编码器-潜变量-图解码器”架构，从片段出发逐步扩展原子/键，生成6,937,677个含目标片段（F1片段 图2）的分子；解码器采用广度优先策略，确保生成分子的拓扑结构稳定。

图 4. 片段修饰对可合成性与抗菌活性的影响 （此图针对金黄色葡萄球菌的化合物设计，流程与前面类似）

(A) 由 S. aureus 抗菌活性模型确定的片段预测得分排名（上）及应用于片段的计算筛选条件（下）。 (B) 可用于实测的化合物（50 μM）片段（上）与化合物（下）的预测得分排名。 (C) 片段 F2 及其对应活性化合物的结构，活性片段在 EN1 中高亮标出。 (D) EN1 的 MIC 和 CC₅₀ 值。n = 2，* 表示 >64 μg/mL。 (E) 片段 F2 与其截短片段 F2′ 的结构，以及 F-CReM 与 F-VAE 模型生成的分子数量。 (F) 对基于片段 F2′ 下筛选出的化合物应用的计算筛选条件。 (G) F-CReM 与 F-VAE 模型使用片段 F2 与 F2′ 生成分子的 RAscore。 (H) 由 ASKCOS 计算的 F-CReM 与 F-VAE 使用片段 F2 与 F2′ 生成分子的逆合成预测成功率。 (I) 来自 Enamine REAL 空间的 12 个含 F2 片段的化合物，以及 16 个基于 F2′ 片段设计并合成的新化合物在 S. aureus RN4220 中的 MIC。 另见图 S4。

（3）第三步：合成筛选——从海量分子到候选化合物

对生成分子施加进一步过滤：①合成可行性（RAscore>0.8，SAscore<3）；②结构多样性（分子间Tanimoto相似度<0.4）；③无β-内酰胺等已知抗菌骨架。筛选出80个化合物，并由商业化学合成供应商进行评估。最终选择27个分子尝试合成，成功获得2个高纯度（>95%）化合物——NG1与NG2（均来自F-VAE模型）。

其中NG1对多重耐药和致病性淋病奈瑟菌菌株具有抗菌活性。

3. 路径二：从头设计——无片段依赖的全新分子生成

为完全摆脱现有片段限制，研究团队构建“无起点”生成模式：

• CReM从头设计：以氨、甲烷、水等简单小分子为起点，通过突变生成分子，共产生106,557个分子；
• JT-VAE（连接树变分自编码器）：无需任何起点，直接学习分子的“骨架-官能团”关联规律，生成28,534,490个分子。

通过与基于片段设计相同的过滤标准，得到4,831种分子，经人工检查后筛选至90种化合物，再由化学合成供应商审查。最终采购22个JT-VAE生成的分子，其中6个（DN1-DN6）表现出抗菌活性，成功率达27.3%。

三、核心成果：两大先导化合物的抗菌活性与临床潜力

研究最终得到24个AI设计分子，7个表现出选择性抗菌活性，其中NG1（针对淋病奈瑟菌） 与DN1（针对金葡菌） 为核心先导化合物，其体外活性、耐药性、体内疗效均达到临床前候选药物标准。

1. NG1：靶向LptA的淋病奈瑟菌精准抑制剂

（1）体外抗菌活性——强效抗耐药

• 抗敏感株：对淋病奈瑟菌ATCC 49226的MIC为0.5μg/mL，是头孢曲松（MIC=0.008μg/mL）的62.5倍，但远优于现有二线药物阿奇霉素（MIC=0.25μg/mL，部分耐药株已达8μg/mL）；
• 抗耐药株：对CDC-FDA耐药菌库中的8株多重耐药淋病奈瑟菌（包括对头孢曲松、阿奇霉素、环丙沙星全耐药菌株）的MIC均≤4μg/mL，无交叉耐药；
• 窄谱选择性：仅抑制致病性奈瑟菌（淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌），对人共生奈瑟菌（黏膜奈瑟菌、灰色奈瑟菌）及其他革兰氏阳性/阴性菌（如大肠杆菌、肺炎克雷伯菌）无抑制作用，可避免破坏肠道菌群。

图 3. 化合物 NG1 的作用机制研究与体内疗效.(A) NG1 对野生型及抗生素耐药株 N. gonorrhoeae 的最低抑菌浓度（MIC，具体菌株列于表 S4）。每个数据点代表重复两次的生物学实验结果。(B) NG1 与阿奇霉素（azithromycin）处理 ATCC 49226 株的时间杀菌曲线。数据以平均值 ± 标准差（Mean ± SD）表示，n = 2。(C) NG1 在 ATCC 49226 株中的最小杀菌浓度（MBC）。Mean ± SD；n = 2。(D) NG1（64 μg/mL）及对照化合物处理 ATCC 49226 后的细胞膜刚性变化，通过 Laurdan 通用极化度（GP）测定。Mean ± SD；n = 2。(E) NG1 与 DMSO 处理 ATCC 49226 后的膜完整性损伤情况，通过疏水性荧光探针 1-N-苯基萘胺（NPN）摄取量测定。Mean ± SD；n = 2。(F) NG1 或 Triton X-100 处理 ATCC 49226 后的膜通透性变化，表现为 SYTOX green 荧光信号随时间增加，并相对于未处理对照归一化。Mean ± SD；n = 2。(G) FA 1090 细胞裂解液经 NG1 处理后的 PISA 分析火山图，与载体对照相比。最显著受影响的蛋白 LptA 以紫色标出。(H) NG1（4× MIC）处理 FA 1090 后 lptA 基因的表达水平，以 log₂ counts-per-million（CPM）表示。(I) NG1 与多黏菌素 B（PMB）在 ARB #0187 菌株中的棋盘式联合实验，显示协同效应。数据为两次独立生物学重复结果。(J) NG1 在 N. gonorrhoeae 阴道感染模型中的体内研究示意图，使用 ATCC 49226 菌株。给药方案为阴道内分别给予载体、NG1 或头孢曲松，共 5 次。(K) 阴道冲洗液中的细菌滴度。横线表示 log₁₀ CFU/mL 的中位数。数据分别代表载体对照（n = 8）、NG1（n = 9）和头孢曲松（n = 5）处理组。与载体组比较的双侧 Mann-Whitney U 检验：*p ≤ 0.05，**p ≤ 0.01。横线为中位数。(L) NG1 的构效关系（SAR）分析总结。另见图 S2 和图 S3。

（2）作用机制——靶向未被开发的LptA蛋白

通过PISA（蛋白质组整体溶解度分析）、RNA-seq、冷冻电镜等技术，证实NG1的作用靶点为LptA（脂寡糖输出系统蛋白）：

• 靶点验证：NG1处理后，LptA蛋白稳定性显著下降（p=1.9×10⁻⁷，log2折叠变化=-2.4），且lptA基因表达呈剂量依赖性上调（4×MIC处理后，表达量增加2.3倍）；
• 作用方式：LptA是淋病奈瑟菌外膜合成的关键蛋白，负责将脂寡糖（LOS）从内膜转运至外膜；NG1结合LptA后，可能抑制其转运功能，导致外膜完整性破坏——表现为NPN（疏水荧光探针）摄取增加3.2倍，SYTOX Green（DNA染料）渗透增加2.8倍；
• 协同作用：与多粘菌素B（靶向脂质A）联用，FIC指数<0.5，呈显著协同效应，进一步证实外膜损伤机制。

（3）体内疗效与安全性

• 动物模型验证：在卵巢切除雌鼠淋病奈瑟菌阴道感染模型中，1% NG1局部给药5次（24小时内），阴道细菌载量降低3个数量级（p=0.012），疗效与0.1%头孢曲松相当；
• 安全性：对HEK293、HepG2、HSkMC细胞的CC₅₀为25-128μg/mL，治疗指数（TI=CC₅₀/MIC）达50-256；无溶血活性（64μg/mL下溶血率<5%），无致突变性（Ames试验阴性），局部给药无黏膜刺激。

2. DN1：广谱抗革兰氏阳性菌的膜活性抗生素

（1）体外抗菌活性——覆盖多重耐药株

• 抗金葡菌：对MSSA（RN4220）、MRSA（BAA1556）的MIC均为4μg/mL，优于万古霉素（MIC=2μg/mL，但部分VISA菌株已达8μg/mL）；
• 抗其他革兰氏阳性菌：对枯草芽孢杆菌、粪肠球菌（万古霉素敏感株）的MIC≤8μg/mL；对CDC-FDA耐药菌库中的VISA（万古霉素中介金葡菌）、ATR（氨基糖苷/四环素耐药菌）、TLZD（恶唑烷酮耐药菌）的MIC均≤8μg/mL，无耐药株逃逸；
• 抗淋病奈瑟菌：虽基于金葡菌模型设计，但对淋病奈瑟菌ATCC 49226的MIC=8μg/mL，展现跨物种活性。

图 6. 新设计化合物 DN1–DN6 的表征

(A) 化合物对 S. aureus RN4220、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA, BAA1556）、N. gonorrhoeae ATCC 49226 的 MIC 以及在三种人源细胞中的 CC₅₀ 值。n = 2，* 表示 >128 μg/mL。 (B) 对多种革兰氏阳性菌（上）、革兰氏阴性菌（中）及与亚抑菌浓度多黏菌素 B 九肽联合（下）的 MIC。n = 2。另见表 S4。 (C) S. aureus RN4220 经 DN1–DN6、缬氨霉素（阳性对照）及 DMSO（阴性对照）处理后的 DiSC₃(5) 荧光变化。 (D) B. subtilis 168 细胞经活性新设计化合物处理（2× MIC，2 小时）后的显微图像。DAPI 染色为蓝色，FM4-64 染色为红色。 (E) 未处理与化合物处理（2× MIC）下 B. subtilis 细胞面积比较；n 为定量细胞数，****p ≤ 0.0001，采用双侧 Mann-Whitney U 检验。 (F) RN4220 经 DN1（32 μg/mL）及对照化合物处理后的膜刚性变化，通过 Laurdan 通用极化度（GP）测定。Mean ± SD；n = 2。 (G) 未处理及 DN1（4× MIC）处理的 S. aureus 的冷冻透射电子显微（Cryo-TEM）图像。 (H) S. aureus 的膜厚度定量分析（未处理 n = 14；DN1 n = 11），****p ≤ 0.0001，采用双侧 Mann-Whitney U 检验。另见图 S6。

（2）作用机制——破坏细菌膜电位与完整性

DN1通过非靶点依赖的膜活性机制发挥作用，与现有抗生素无交叉耐药：

• 膜电位干扰：DN1处理后，金葡菌的DiSC₃(5)荧光显著增加，表明细胞膜电位（ΔΨ） dissipation；而pH梯度（ΔpH）无变化，提示其特异性破坏膜电位；
• 膜流动性改变：Laurdan染色显示，DN1处理后金葡菌膜流动性降低（GP值增加0.3），导致膜蛋白功能紊乱；
• 形态学变化：冷冻电镜显示，DN1处理后金葡菌细胞膜增厚（从10nm增至13nm）、周长增加15%；淋病奈瑟菌出现膜脱落、细胞肿胀，证实膜损伤是杀菌核心机制。

（3）体内疗效与耐药性

• 动物模型验证：在中性粒细胞减少小鼠MRSA皮肤感染模型中，1% DN1局部给药6次（25小时内），皮肤细菌载量降低10倍（p=0.0043），疗效与0.25%夫西地酸（临床常用药）相当；
• 低耐药风险：自发耐药频率<9.6×10⁻⁹（4×MIC下无耐药菌落生长），连续传代30次后MIC无显著升高，远优于万古霉素（传代10次后MIC可升高4倍）。

四、结构优化：基于SAR的分子活性提升

为进一步验证AI设计分子的可优化性，研究团队针对NG1与DN1开展结构-活性关系（SAR）分析，为后续临床开发提供方向：

1. NG1的SAR规律

合成74个NG1类似物，重点修饰吡咯烷环的R1基团与胺基的R2基团，发现：

• R1基团影响活性：含2,3-二氯苯基的类似物（如NG1-164）MIC=4μg/mL，优于2,4-二氯苯基（MIC=16μg/mL）及单氯苯基（MIC=32μg/mL）；
• R2基团影响选择性：含1,2,3-三唑环的类似物对人细胞毒性更低（CC₅₀>128μg/mL），TI提升至>32；
• 核心片段必需性：删除F1片段后，分子完全丧失抗菌活性，证实片段是活性核心。

2. DN1的SAR规律

合成19个DN1类似物，修饰芳环卤素位置与中心吡咯烷环，发现：

• 卤素位置关键：芳环间位（meta）Cl/F取代的类似物（如DN1-164）MIC=2μg/mL，优于邻位（ortho）取代（MIC=8μg/mL）；
• 环大小容忍性：中心吡咯烷环可替换为4-6元含氮杂环（如哌啶环），活性无显著下降（MIC=4μg/mL）；
• 羧基必需性：删除羧基后，分子MIC>128μg/mL，证实羧基是与膜结合的关键基团。

五、研究创新点与局限性

1. 三大核心创新

• 技术创新：实现“片段筛选-AI生成-体内验证”的全流程从头设计，两种生成路径（基于片段/无起点）覆盖不同应用场景，为抗菌药物研发提供可复用平台；
• 机制创新：发现首个候选药物以淋病奈瑟菌的LptA为抗菌靶点，打破现有靶点局限；DN1的膜活性机制为对抗“泛耐药菌”提供新思路；
• 效率创新：AI生成分子的活性成功率达29.2%（7/24），远高于传统筛选的0.1%-1%，且从设计到合成验证仅需6个月，大幅缩短研发周期。

2. 现存局限性

• 合成可及性挑战：AI生成的3600万分子中，仅80个进入合成阶段，最终成功合成24个，合成成功率不足0.001%；
• 体内给药途径局限：NG1与DN1目前仅验证局部给药（阴道/皮肤），需进一步优化水溶性、代谢稳定性，以实现全身给药（如静脉注射）；
• 长期耐药性监测：动物模型仅验证短期疗效，需长期传代实验与大动物模型验证耐药性进化规律。

总结

本文通过生成式深度学习技术，打破了传统抗生素研发的 化学空间局限 与 耐药性困境 ，实现从 片段/简单分子 到 临床前候选化合物 的全流程AI设计，并通过靶点验证、体内疗效证实其可行性。这项研究不仅为耐药菌感染治疗提供了两款潜在新药，更建立了一套可复用的AI抗菌药物研发策略——未来，随着多目标优化、合成技术的突破，生成式AI有望成为抗菌药物研发的核心工具。

参考文献：Krishnan A, Valeri J A, Jin W, et al. A generative deep learning approach to de novo antibiotic design[J]. Cell, 2025.