Wnt/β-连环蛋白信号通路及其失调在干细胞命运决定和多种疾病的病理中起着关键作用。然而，翻译后的Wnt配体在再生医学中的应用受其疏水性以及与Frizzled（FZD）受体的交叉反应性的限制。在这里，产生了一种合成关键受体调节剂——FZD激动剂RRP-pbFn，用于在不直接与LRP5/6结合的情况下高效激活Wnt/β-连环蛋白信号通路。RRP-pbFn显示出比替代Wnt更高的效力，支持各种小鼠和人类类器官的生长，并在体内诱导肝脏和肠道前体细胞的扩增。与此互补，开发了一种合成LRP拮抗剂RRP-Dkk1c，其在抑制Wnt/β-连环蛋白信号活动方面显示出比Dkk1更高的有效性，从而消除了CT26衍生结肠癌异种移植瘤在体内的形成。总体而言，这两种针对单一类型细胞表面受体的成对关键受体调节剂为生物医学研究和潜在治疗提供了巨大的前景。

Wnt/β-连环蛋白信号通路通过调控干细胞的自我更新和谱系分化，严格控制胚胎发育和组织稳态

[1,2] 。WNTs与受体Frizzled (FZD)和低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6 (LRP5/6)形成异二聚体，从而触发核心效应蛋白β-连环蛋白在细胞质中的累积，然后转入细胞核进行靶基因转录[3,4]。 

Wnt/β-连环蛋白信号的失调与多种疾病的病理过程有关

，包括发育缺陷、癌症和退行性疾病[1,5,6] 。因此，体内调控Wnt/β-连环蛋白信号活性将有助于开发新的治疗策略。体外干细胞扩增和程序化分化为再生医学带来了曙光。由于Wnt/β-连环蛋白信号调控干细胞自我更新，其激动剂已被用于维持干/祖细胞的扩增。尤其是新兴的类器官，通过对成年干细胞的受控命运决定而获得，在建模各种发育事件和疾病、药物发现、精准医疗及再生治疗方面显示出巨大优势[7–9] 。设计更高效、稳定的Wnt调节剂将显著推进干细胞相关技术的发展，特别是类器官培养。

对于Wnt/β-连环蛋白信号通路，细胞内激动剂具有更高的非靶向效应风险，例如糖原合酶激酶3（GSK3）抑制剂CHIR在Wnt/β-连环蛋白信号之外对多种细胞途径具有调节作用，并导致比Wnt3a配体或其替代物更广泛的全局基因表达改变[10] 。细胞外信号配体结合特定细胞表面受体以启动信号转导。因此，

发挥天然配体功能的信号受体激动剂或拮抗剂能够在不穿透细胞膜的情况下精确调控信号级联，这在特异性、安全性和递送方面相比细胞内靶向策略具有巨大优势

[11]。 然而，由19种哺乳动物WNT与10种FZD亚型（FZD 1–10）之间的保守相互作用位点引起的广泛相互作用，阻碍了明确地将不同下游反应归因于单个FZD亚型[12]。 此外，WNT经过称为Porcupine的O-酰基转移酶介导的翻译后棕榈酰化，这是WNT分泌和与FZD相互作用所必需的[13,14]。 由于其棕榈烯酸基团，WNT表现出高度疏水性，这需要使用去污剂进行纯化，因此在纯化和使用重组WNT时存在挑战[14] 。Wnt3a 条件培养基（CM）通常用作Wnt/β-连环蛋白信号激活剂。然而，Wnt3a CM的确切组成尚未完全确定，这在实验环境中引入了不可控的变量[15]。

此外，FZD 亚型特异性下一代替代 Wnt（sWnt/pbF-Dkk1c，也称为 NGS Wnt），涉及将 FZD 的蛋白结合体（pbF，也称为设计重复蛋白结合体（DRPB）[16] ，可与 FZD1、2、5、7、8 结合）连接到人 Wnt 拮抗剂 Dkk1 的 C 端结构域（Dkk1c），以及基于四聚体抗体的 Wnt 拮抗剂，被报道为大分子[16–19] 。目前的替代 Wnt 激动剂可诱导 FZD-LRP 的异二聚化或寡聚化，但表现出较弱的通路激活，同时可绕过内源性 Wnt 的需求。此外，其临床转化受到内源性配体制造难题的阻碍，加上 Wnt 激动剂活性不佳且分子量过大。值得注意的是，无论是天然 Wnt 配体还是现有的替代 Wnt 都依赖于通过自然机制形成配体-受体复合物。因此，开发一种合成调节剂以靶向关键受体而不依赖天然配体机制是至关重要的。

由于泛素连接酶 RNF43/ZNRF3 的突变失活或 R-spondin 融合，Wnt 受体活性的异常增加最近被确定为癌症发展的一个重要驱动因素[20–22] 。针对经典 Wnt 受体的拮抗剂有望用于治疗这些特定的癌症亚群[23–25] 。因此，合成 LRP 拮抗剂的开发在治疗应用方面具有广阔前景。

在这里，我们报告了两种合成关键受体调节剂的发展，它们针对不同类型的细胞表面受体：

，由 RRP（光遗传学工具 pMag 的截断）与 pbFn（pbF 的 N 端结构域）

。与改良替代 Wnt（Dkk1c-pbF）相比，RRP-pbFn 展现出不同的特性，因为它不直接与 LRP5/6 受体结合，分子量更低，并且更有效地激活 Wnt/β-连环蛋白信号通路。RRP-pbFn 在支持不同类型类器官的生长和扩展方面表现出强大的作用，包括小肠、肺泡、胃、肝细胞和胆管细胞。此外，我们展示了 RRP-pbFn 在体内调节代谢性肝区分和促进成人肠道增生的疗效。合成的 RRP-Dkk1c 在抑制 Wnt/β-连环蛋白信号通路方面表现出优越疗效，相较于 Dkk1，可抑制类器官生长并在 CT26 异种移植物模型中有效抑制肿瘤生长。值得注意的是，这些具有

人工设计的水溶性特性和小分子量的关键受体调节剂

，在推进再生医学的研究和转化应用方面具有巨大潜力，同时为开发其他信号通路的关键受体调节剂提供了一种可适应的方法。

2.1. Generation of a Synthetic Frizzled Agonist for High-Efficiency Wnt/𝜷-Catenin Signaling Activation

细胞信号传导的精确时空控制在再生医学和组织发育研究中有广泛应用[29,30] 。我们最初的目标是开发一种光控的 sWnt，用于 Wnt/β-连环蛋白信号的时空控制。工程化的光开关Magnet（pMag/nMag）可通过光诱导异源二聚化，被用于创建光遗传学工具[26]。 我们通过将 sWnt 片段（pbF/Dkk1c）的拆分部分与 pMag/nMag 融合，采用了这一光激活的 Magnets 二聚化系统（图 S1A，支持信息）。理论上，通过光诱导的 pMag/nMag 异源二聚化可以功能性恢复拆分的 sWnt 片段（图 S1B，支持信息）。sWnt/Magnets 半部的变体单独或组合转染到人胚肾 293T (HEK 293T) 细胞中，同时转入 TOP-Flash 和 Renilla 报告系统。随后在有光或无光条件下测定荧光素酶活性。然而，基于 pMag/nMag 的 sWnt 系统在照明后并未显示增强的 TOP-Flash 信号，表明将 sWnt 拆分为 pbF 和 Dkk1c 对于 Magnets 光开关控制的 sWnt 活性并不适用（图 S1C，支持信息）。令人惊讶的是，即使没有组合或蓝光，单独的 pMag-pbF 也会诱导显著且强烈的 Wnt 激活（图 S1C，支持信息）。

在观察到由 pMag-pbF 融合蛋白触发的强 Wnt 激活后，我们接着测试了 pMag 和 pbF 是否可以单独或组合激活 Wnt/β-连环蛋白信号传导。结果显示，只有 pMag-pbF 融合蛋白对 TOP-Flash 信号显示出 29.8 倍的可诱导效应，而单独的 pMag、单独的 pbF 或它们的组合均未表现出这种效应（图 1A）。所有蛋白均在超natant 中表达并分泌，数量可比（图 S2A，补充信息）。50% 的 pMag-pbF 条件培养基（CM）也能激活 Wnt/β-连环蛋白信号（图 1B）。有趣的是，我们观察到方向性对 pMag-pbF 融合蛋白的活性有影响，其中 pbF-pMag（pbF 融合于 pMag 的 N 端）在诱导 Wnt 激活方面的活性低于 pMag-pbF（pMag 融合于 pbF 的 N 端）（图 1C）。此外，pMag-pbF 与 Wnt 增强剂 R-spondin1[31] 显示出协同作用，这通过 HEK 293T 细胞中 TOP-Flash 报告基因表达增强得以证明（图 1D）。将来源于丝状真菌 Vivid (VVD) 的蓝光光受体的氨基酸残基 Ile52 和 Met55 分别替换为 R/R (I52R/M55R) 或 D/G (I52D/M55G) 就产生了 pMag 和 nMag[26] 。随后，我们研究了 nMag-pbF 和 VVD-pbF 融合蛋白诱导 Wnt/β-连环蛋白信号的能力，但未观察到激活（图 1E）。对pMag、VVD和nMag蛋白的结构分析表明，结构变异仅限于特定的氨基酸残基52和55（图1F）。基于这一观察，我们推测pMag蛋白中的R52和R55残基对于pMag-pbF的激动剂活性至关重要。为验证该假设，我们构建了将R52替换为I或R55替换为M的pMag突变体，分别得到pMag(R52I)和pMag(R55M)（图1F），随后将其与pbF融合。我们的结果证实了该假设：与pMag-pbF相比，pMag(R55M)-pbF的活性降低，而pMag(R52I)-pbF则完全失去活性（图1E）。

合成激动剂的效用和可药物性很大程度上取决于分子量。随后，我们分别截断pMag和pbF，探索了Wnt/β-catenin信号激活效率最高的变异蚁。pMag（总共150个aa）和pbF（总共190个aa）的截断变体通过逐步从NorC末端删除30个aa生成（图1G，I）。我们进行了western blot，确保p镁融合的trunc变体与pbF的表达，结果显示融合蛋白数量相当（见图S2B，支持信息）。在pMag（pMag（1-120））与pbF的前120 aa融合后，pMag（1-120）-pbF表现出最强的Wnt活化，而pMag（1-90）-pbF的前90个aa与pbF融合时，其活性相较pMag-pbF下降（见图1H）。尽管pMag fu sion与pbF（pMag（1-60）-pbF）的前60个aa表现出弱活性，但前60个pMag与pbF融合的aa（pMag（1-60 91 120）-pbF）恢复了活性。因此，我们将pMag（1-120）命名为RRP。随后，western blot 结果显示截断融合的RRP-pbF表达水平相当（见图S2C，辅助信息）。在pbF（pbF（1-130））与RRP融合的前130 aa后，RRP-pbF（1-130）的激活力强于RRP-pbF（1-190）（见图1J），pbF（1-130）被命名为pbF的N端结构域（pbFn）。此外，RRP-pbFn诱导的Wnt激活在蓝光照射后保持不变（图S3A，支持组）。通过在pMag（R52I）和pMag（R55M）中对RRP进行诱变，我们观察到RRP（R55M）-pbFn表现出di活性减弱，而RRP（R52I）-pbFn则无活性，这与pMag-pbF的行为一致（见图1K）。此外，pbFn和RRP（R52I）-pbFn抑制了由RRP-pbFn诱导的Wnt/β链蛋白信号激活（图S3B，支持信息）。

2.2. RRP-pbFn Activates Wnt/𝜷-Catenin Signaling More Potently than Improved Surrogate Wnt

我们着手确定FZD激动剂RRP-pbFn是否具有更强的Wnt/β-连环蛋白信号激活能力。先前报道的sWnt（pbF-Dkk1c）能够诱导Wnt/β-连环蛋白信号活动[16]，并且当LRP6结合蛋白与FZD结合蛋白的N端融合时，相比另一种方向，显示出更高的活性[17]。因此，我们使用HEK 293T细胞中的Wnt报告测定，以剂量依赖的方式比较改进的替代Wnt（Dkk1c-pbF）与RRP-pbFn的活性。即使在低浓度下，RRP-pbFn也比改进的替代Wnt在有或没有R-spondin1的情况下诱导更强的剂量反应和更强的Wnt/β-连环蛋白信号（图1L）。此外，RRP-pbFn的分子量相对于改进的替代Wnt也更小（图1L）。为了分析β-连环蛋白的稳定性，我们进行了蛋白质分析，结果显示RRP-pbFn相比Dkk1c-pbF显著诱导了更强的β-连环蛋白稳定性（图S4A，支持信息）。总之，RRP-pbFn是一种具有更小分子量的水溶性合成FZD激动剂，其激活Wnt/β-连环蛋白信号的能力远强于改进的替代Wnt。这些结果表明，靶向FZD可能是发现新一代Wnt激动剂的一个有前景的策略。

2.3. RRP-pbFn Facilitates the Growth of Various Mouse and HumanOrganoids

由于Wnt/β-连环蛋白信号在组织干细胞自我更新及体外长期维持中发挥主导作用，其配体及/或替代物被广泛用于干/祖细胞甚至类器官的培养系统中[16,32,33] 。我们评估了RRP-pbFn作为新一代Wnt/β-连环蛋白激动剂在支持类器官培养中的潜力。从小鼠小肠、肺泡、胃、肝细胞以及人胆管细胞生成了多种类器官，然后在有或没有重组RRP-pbFn的情况下进行培养。基础培养基培养的小肠类器官显示出先前描述的正常形态[33] ，而RRP-pbFn支持的类器官则成为薄壁囊状结构，表明增殖更多（图2A）。RRP-pbFn 显示出胃来源类器官数量以及肺泡、肝细胞和人胆管细胞来源类器官面积的显著改善（图 2B–E）。此外，这与 RRP-pbFn 对 Wnt 靶基因 Lgr5 和 Axin2 转录水平的增强高度一致（图 2F）。随后，将 RRP-pbFn 和 Dkk1c-pbF 蛋白施用到胆管细胞类器官中。与 Dkk1c-pbF 相比，RRP-pbFn 在类器官面积上的改善显著更大（图 S4B，补充信息）。总体而言，这些发现表明 RRP-pbFn 支持多种类器官模型的生长。

2.4. RRP-pbFn Induces the Expansion of Liver and Intestine Progenitors Through Manipulating Wnt/𝜷-Catenin Signaling In Vivo

作为 FZD 激动剂，RRP-pbFn 在近生理类器官中表现出高效且稳定的调控细胞命运决定能力，我们随后转向验证 RRP-pbFn 是否在体内发挥作用。成年肝脏分区和肠干细胞扩增的生理过程代表了典型的 Wnt 响应事件。[1,16,34] 为了评估 RRP-pbFn 的体内活性，我们使用了腺相关病毒 8 型（AAV-8），这是一种可以感染肝细胞的输送系统。[35] RRP-pbFn 与小鼠 IgG Fc 片段（Fc）融合，以延长循环半衰期。随后，小鼠被注射表达 RRP-pbFn-Fc 或作为阴性对照的 Fc 的 AAV-8，并进一步注射有或无重组 R-spondin1（图 S5A，支持信息）。通过 qRT-PCR 分析验证了 AAV 介导的 RRP-pbFn-Fc 在小鼠肝脏中的表达（图 S5B，支持信息）。在肝脏中，WNTs 在中央静脉（CV）附近表达，Wnt/β-连环蛋白信号的激活触发邻近肝细胞的中央周基因表达程序，[36] 包括谷氨酰胺合成酶（GS），从而扰动代谢分区（图 3A）。我们观察到，单独使用 AAV-RRP-pbFn-Fc 并未显著影响肝脏 GS 表达，但与重组 R-spondin1 联合治疗则诱导了 GS 表达的中心周区协同扩张（图 3B、C），并且与对照小鼠相比，上调了 GS 和 Axin2，同时抑制了门静脉周标记物 Cyp2f2 mRNA（图 3D）。

在小肠中，Wnt/β-连环蛋白信号激活刺激隐窝增生，并扩增有丝分裂 Ki67 上皮细胞（图 3E）。静脉注射后，AAV-8 能感染小鼠肝细胞，从而持续分泌转基因产物进入血液循环。AAV-RRP-pbFn-Fc 感染适度诱导了从隐窝向绒毛底部区域延伸的 Ki67 表达（图 3F）。因此，我们的结果确认 RRP-pbFn 能在体内激活 Wnt/β-连环蛋白信号，改变肝脏代谢分区，并诱导肠绒毛增生。

2.5. RRP-pbFn Does Not Bind to LRP, but Triggers FZD-LRP Interaction for Wnt/𝜷-Catenin Signaling Activation

当Wnt配体结合到共受体FZD和LRP5/6时，Wnt/β-连环蛋白信号通路被激活，导致两个受体的二聚化。已知RRP-pbFn激活Wnt/β-连环蛋白信号依赖于FZD受体的招募。为了确定RRP-pbFn是否通过直接结合LRP5/6受体并对FZD的选择性来激活Wnt/β-连环蛋白信号，我们在HEK 293T细胞中进行了共免疫沉淀（Co-IP）实验。结果显示，LRP5胞外结构域（LRP5E1E4）和LRP6胞外结构域（LRP6E1E4）可以与sWnt共免疫沉淀，但不能与RRP-pbFn共免疫沉淀（图4A）；RRP-pbFn强烈与FZD5和FZD7相互作用，并与FZD1呈中等相互作用（图4B），这表明RRP-pbFn激活Wnt/β-连环蛋白信号时，主要针对特定类型的细胞表面受体（FZD），而不与LRP5/6受体结合。

为了确定RRP-pbFn激活的FZD在没有LRP的情况下是否能够刺激Wnt/β-连环蛋白信号传导，使用了短发夹RNA（shRNA）来抑制LRP5/6的表达，并通过qRT-PCR分析确认敲低效率（图S6A,B，支持信息）。研究发现，LRP5/6 shRNA介导的LRP5和LRP6敲低抑制了RRP-pbFn或sWnt诱导的Wnt反应，这通过HEK 293T细胞中TOP-Flash报告基因的表达降低得以证明（图4C；图S6C，支持信息）。随后，我们过表达Dkk1c以抑制LRP5/6在Wnt信号传导启动中的功能，这导致sWnt的Wnt/β-连环蛋白信号激活消失，并抑制了RRP-pbFn诱导的Wnt/β-连环蛋白信号激活（图4D；图S6D，支持信息）。为了进一步探讨干扰内源性跨膜受体FZD和LRP5/6二聚化对Wnt/β-连环蛋白信号激活的影响，我们过表达了LRP5胞外结构域LRP5E1E2、LRP5E3E4以及LRP6胞外结构域LRP6E1E2、LRP6E3E4。我们发现，减弱内源性受体FZD与LRP5/6之间的相互作用会抑制RRP-pbFn或sWnt诱导的Wnt/β-连环蛋白信号激活（图4E；图S6E，支持信息）。LRP6胞质尾部的磷酸化对于β-连环蛋白的稳定化及随后的Wnt/β-连环蛋白激活至关重要。[1] 实际上，RRP-pbFn诱导的LRP6磷酸化比sWnt更强（图4F）这些发现表明 

RRP-pbFn 激活了 Wnt/𝛽-连环蛋白信号通路，而不是通过结合 LRP5/6 受体，而是触发了 FZD-LRP 相互作用。

将VVD的Ile52和Met55替换为带正电荷的精氨酸残基（I52R/M55R）生成了pMag，而使用带负电荷的天冬氨酸和甘氨酸（I52D/M55G）则生成了nMag。[26] 我们发现pMag-pbF显著激活了Wnt/β-连环蛋白信号通路，但nMag-pbF或VVD-pbF未能做到这一点（图1E）。值得注意的是，将带正电荷的精氨酸残基R52替换为异亮氨酸（RRP(R52I)-pbFn）消除了其Wnt激活能力（图1K）。为评估氨基酸电荷是否影响RRP-pbFn激活Wnt/β-连环蛋白信号通路的能力，我们将R52替换为其他带正电荷的赖氨酸或组氨酸残基。意外地，RRP(R52K)-pbFn和RRP(R52H)-pbFn都未显示出活性，但它们仍与FZD7相互作用，表明pMag-pbF的Wnt激活机制与电荷无关（图S7A,B，支持信息）。为了研究RRP是否通过诱导ZNRF3抑制并增加Wnt受体的膜水平来模拟R-spondin，[21] 我们评估了用这些配体处理的细胞中FZD7的蛋白水平。与增加FZD7的R-spondin1不同，RRP-pbFn或sWnt未改变FZD7蛋白水平（图S7C，支持信息）。我们研究了额外的信号通路 Smo、TGF-β 和 Yap，这些通路与 Wnt 通路有间接联系，以确定 pMag 或 RRP-pbFn 是否激活这些通路，这些通路最终汇聚于 Wnt/β-连环蛋白信号传导。结果表明，无论是 pMag、pMag-pbFn 还是 RRP-pbFn 都未激活这些通路（图 S7D,E，支撑信息）。

2.6. Generation of High-Efficiency LRP Antagonist by Fusing RRP with Dkk1c

鉴于RRP(R52I)-pbFn抑制了由RRP-pbFn诱导的Wnt/β-连环蛋白信号激活（图S3B，支持信息），我们继续探究其作为抑制sWnt诱导的Wnt/β-连环蛋白信号的拮抗剂的潜力，结果显示出适度的拮抗作用（图S8，支持信息）。为了开发一种能够有效阻断Wnt配体或sWnt依赖的Wnt/β-连环蛋白信号激活的合成拮抗剂，我们用高亲和力的LRP5/6受体结合蛋白Dkk1或Dkk1c替换了pbFn，考虑到10个FZD受体的部分冗余性以及pbFn对FZD1、2、5、7和8的特异性结合。[28,37] 正如预期，无论是否存在R-spondin1，Dkk1和Dkk1c都部分阻断了sWnt诱导的Wnt反应，而RRP-Dkk1表现出进一步抑制作用，RRP-Dkk1c则完全抑制Wnt/β-连环蛋白信号激活至不到5%（图5A,B），且与RRP(R52I)-pbFn相比，RRP-Dkk1c显示出更优的抑制活性（图S8，支持信息）。此外，我们证实了RRP-Dkk1c能够与LRP6外段相互作用（图S9，支持信息）。通过对RRP(R52I)和RRP(R55M)进行诱变（图1K），我们意外地观察到RRP(R52I)-Dkk1c和RRP(R55M)-Dkk1c抑制了sWnt引发的Wnt/β-连环蛋白信号激活（图5C）。这些结果表明，RRP在与pbFn和Dkk1c融合时发挥了不同的调节作用。

2.7. RRP-Dkk1c Shows a Much Higher Capacity for Wnt/𝜷-Catenin Signaling Inhibition than Currently Available LRP Antagonist

我们比较了Dkk1与RRP-Dkk1c在HEK 293T细胞中通过Wnt报告基因检测以剂量依赖方式抑制Wnt/β-连环蛋白信号的能力。RRP-Dkk1c在抑制sWnt诱导的Wnt/β-连环蛋白信号激活方面显示出比Dkk1更高的能力（图5D）。此外，RRP-Dkk1c的分子量比Dkk1更小（图5D）。总之，水溶性LRP拮抗剂RRP-Dkk1c显示出更小的分子量，但其抑制活性比Dkk1更强。

我们评估了LRP拮抗剂RRP-Dkk1c在类器官生长过程中的作用。用重组RRP-Dkk1c处理小鼠肠隐窝导致整体类器官存活率显著下降（图5E）。此外，应用重组RRP-Dkk1c还导致小鼠胃来源类器官数量减少，以及在sWnt补充培养基中培养的肺泡、肝细胞和人胆管细胞来源类器官体积缩小（图5F–I）。一致地，这些类器官中Wnt靶基因Lgr5和Axin2的mRNA水平被重组RRP-Dkk1c显著下调（图5J）。总之，我们的研究结果提供了合成LRP拮抗剂RRP-Dkk1c在抑制类器官生长方面具有强效抑制作用的证据。

2.8. RRP-Dkklc Abolishes the Formation of CT26-Derived ColonCancer Xenograft

对来自Human Protein Atlas数据集的595名结直肠癌患者进行的Kaplan-Meier分析显示，与低Dkk1表达的样本（n = 140）相比，高Dkk1表达的结肠癌样本（n = 455）与生存率显著增加相关（图S10，补充信息），提示Dkk1在Wnt/β-连环蛋白信号通路中的抑制作用与结直肠癌患者的总体生存率较高相关。为了评估RRP-Dkk1c作为体内肿瘤生长抑制剂的潜力，通过皮下注射稳定的CT26细胞建立了异种移植模型，这些细胞在体外能够快速增殖（图6A,B）。CT26是一株未分化的结肠癌细胞系，不存在Apc突变，[38]被选为研究RRP-Dkk1c作用的合适模型。通过慢病毒感染的细胞被排序以生成稳定表达RRP-Dkk1c-Fc或作为对照的Fc的CT26细胞。值得注意的是，克隆形成实验显示，RRP-Dkk1c-Fc稳定CT26细胞的克隆生长显著抑制，第七代后细胞计数为1.88 × 10¹⁰，而对照细胞为3.24 × 10¹⁰（图6A）。与体外结果一致，将5.0 × 10⁵对照细胞注射到小鼠体内可形成肿瘤，而注射RRP-Dkk1c-Fc稳定CT26细胞的小鼠则未显示肿块迹象（图6C,D）。这些结果共同证明了RRP-Dkk1c在结肠癌中的强效抑瘤特性。

总之，我们描述了针对FZD/LRP受体的Wnt/β-连环蛋白信号通路激动剂/拮抗剂。

合成的RRP-pbFn可作为水溶性FZD激动剂，克服了天然配体高疏水性和低活性等限制

。这一进展为类器官扩展和Wnt依赖的再生医学的发展开辟了途径。相反，合成的LRP拮抗剂RRP-Dkk1c能够有效抑制癌症治疗中的Wnt/β-连环蛋白信号通路。总体而言，这些调节剂在科学研究和广泛的生物医学应用中具有巨大潜力。

WNT的疏水性阻碍了其衍生物在研究和治疗中的应用。替代Wnt（pbF-Dkk1c）的鉴定标志着研究工具发展的一大进步。此外，改良的替代Wnt（Dkk1c-pbF）在激活Wnt/β-连环蛋白信号通路方面表现出持续的效能。尽管取得了这些进展，我们报告了一种更强效的Wnt激动剂RRP-pbFn，它由光遗传工具pMag的前120个氨基酸和pbF的前130个氨基酸组成。此外，可溶于水的RRP-pbFn，其低分子量特征克服了抗体型Wnt激动剂因具有两个FZD和LRP结合位点而带来的大分子尺寸挑战。 凭借这些优点，RRP-pbFn促进了多种小鼠和人类类器官的生长，表明RRP-pbFn是经典Wnt激动剂的有前景替代品（图2），为类器官培养提供了新的标准化方案。此外，利用AAV递送系统结合体内R-spondin1，RRP-pbFn在肝脏和肠道显示出强大的再生效果（图3）。RRP-pbFn在体内的活性为基于干细胞的组织再生提供了新的治疗机会。

在细胞表面，Wnt/β-连环蛋白信号轴涉及由Wnt配体、FZD受体和LRP受体组成的三元复合物。[41] 融合蛋白RRP-pbFn，将RRP与针对FZD受体的结合子结合在一起，可强烈刺激Wnt/β-连环蛋白信号（图1）。相反，将RRP与针对LRP受体的结合子融合的RRP-Dkk1c，其抑制能力相比单独的Dkk1c有所增强（图5A,B）。这些数据共同表明RRP可能偏向于LRP受体。RRP-pbFn并不直接与LRP结合，而是促进LRP6的磷酸化以激活Wnt/β-连环蛋白信号。此外，我们确认这种激活与电荷无关。由于RRP来源于光遗传工具pMag/VVD，其中VVD可以形成二聚体，目前尚不清楚RRP-pbFn自身是否形成二聚体或可能通过液-液相分离形成大的复合物来激活Wnt/β-连环蛋白信号。需要进一步研究以阐明LRP6在RRP-pbFn与FZD结合后磷酸化的分子机制及结构-功能关系，以及RRP在Wnt/β-连环蛋白信号激活中的作用。为了全面了解RRP-pbFn如何激活Wnt/β-连环蛋白信号，还需要额外的研究，如质谱分析、近邻标记技术（如TurboID）以及结构生物学方法。我们预期这些努力将提供对其潜在机制的更深入理解。

肿瘤细胞的增殖在体外和体内环境中可能有所不同，因为后者涉及更复杂的微环境因素。然而，我们的体外实验清晰地表明，RRP-Dkk1c-Fc介导的增殖抑制是肿瘤细胞内在的，并依赖于Wnt/β-连环蛋白信号（图6A）。此外，体内移植实验也支持这一结论。实际上，RRP-Dkk1c-Fc的抑制效果比体外更强（肿瘤几乎消失，图6C、D），这表明RRP-Dkk1c-Fc不仅影响细胞增殖的内在机制，还通过干扰其微环境抑制肿瘤形成。各种人类癌症类型的发展和进展与Wnt受体的表达增强有关，这归因于泛素连接酶RNF43/ZNRF3的突变失活。这强调了RRP-Dkk1c作为靶向Wnt依赖性癌症的潜在治疗策略的可能性。蛋白衍生激动剂和拮抗剂的多样化三级结构增强了它们与特定受体口袋的相互作用，使它们相比小分子具有更高的效力和更低的毒性。

我们的研究为探索针对FZD/LRP受体的关键受体调节剂提供了重要的研究范式，促进了信号转导的转化应用。此外，通过人工或基于人工智能设计的合成蛋白质库为干细胞研究、类器官开发、再生医学和疾病治疗开辟了新的前景。

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/pdfdirect/10.1002/smtd.202500425

合成Frizzled激动剂和LRP拮抗剂在类器官培养和体内对Wnt/β-连环蛋白信号通路的调控

Wnt/β-连环蛋白信号通路及其失调在干细胞命运决定和多种疾病的病理中起着关键作用。然而，翻译后的Wnt配体在再生医学中的应用受其疏水性以及与Frizzled（FZD）受体的交叉反应性的限制。在这里，产生了一种合成关键受体调节剂——FZD激动剂RRP-pbFn，用于在不直接与LRP5/6结合的情况下高效激活Wnt/β-连环蛋白信号通路。

其他

本研究发现新型合成FZD激动剂RRP-pbFn，在不结合LRP5/6受体的前提下高效激活Wnt/β-连环蛋白信号，其活性优于现有替代Wnt，可在体外促进多类小鼠及人类类器官生长，并在体内诱导肝脏与肠道前体细胞扩增。与之互补，研发的合成LRP拮抗剂RRP-Dkk1c对Wnt信号抑制效果优于Dkk1，能显著抑制结肠癌异种移植瘤形成。这些水溶性、小分子量的关键受体调节剂为再生医学与癌症治疗提供了新的工具与潜在疗法。

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本研究发现新型合成FZD激动剂RRP-pbFn，在不结合LRP5/6受体的前提下高效激活Wnt/β-连环蛋白信号，其活性优于现有替代Wnt，可在体外促进多类小鼠及人类类器官生长，并在体内诱导肝脏与肠道前体细胞扩增。与之互补，研发的合成LRP拮抗剂RRP-Dkk1c对Wnt信号抑制效果优于Dkk1，能显著抑制结肠癌异种移...

合成Frizzled激动剂和LRP拮抗剂在类器官培养和体内对Wnt/β-连环蛋白信号通路的调控

合成Frizzled激动剂和LRP拮抗剂在类器官培养和体内对Wnt/β-连环蛋白信号通路的调控

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