Nat. Biotechnol. | 人工智能优化逆转录酶，推动Prime Editing迈向新高度

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Prime editing（PE）是一类能够实现“搜索—替换”式精准基因编辑的重要工具，但现有系统虽然经过实验室进化优化了催化活性，却也因此引入了新的问题：逆转录酶（RT）的稳定性下降、可溶性表达减少以及蛋白折叠效率变差。这些问题会限制Prime editor在细胞中的有效浓度，尤其是在mRNA递送、LNP递送以及体内治疗等瞬时表达场景下，最终影响编辑效率。

在这项研究中，研究人员利用人工智能引导的蛋白质重设计策略，对已经经过实验室进化的RT结构进行重新优化。研究人员采用ProteinMPNN等基于结构的深度学习模型，在保留催化核心区域的前提下，对RT的大量外围残基进行重新设计。新的RT变体包含30–163个氨基酸替换，但依然能够保持逆转录功能，同时显著提升热稳定性、蛋白折叠稳定性和可溶表达水平。

研究结果表明，新设计的PE8系列Prime editors在多种细胞类型、不同递送方式以及小鼠体内实验中均表现出更高编辑效率。在部分体内模型中，其编辑效率相比此前最先进的PE6、PE7和PEmax系统最高提升达2.9倍。该研究证明，AI驱动的蛋白重设计可以作为实验室进化的重要补充，为下一代基因编辑工具开发提供一种通用策略。

Prime editing是一种结合Cas9 nickase与逆转录酶的精准基因编辑技术，能够在不产生DNA双链断裂的情况下，实现碱基替换、小片段插入和缺失等多种编辑操作。由于其编辑精度高、副产物较少，因此被广泛认为是最具潜力的下一代基因治疗工具之一。目前，Prime editing已经被用于多种遗传疾病动物模型修复，并在慢性肉芽肿病等疾病中展现临床应用潜力。

过去几年中，研究人员已经通过蛋白工程和实验室连续进化技术不断优化Prime editor。例如PE6系列通过PACE（phage-assisted continuous evolution）获得了更高逆转录活性和编辑效率。然而，这类实验室进化往往会带来典型副作用：蛋白稳定性下降。许多通过定向进化获得高活性的蛋白，实际上会因为折叠不稳定、聚集增加或表达降低而难以真正应用于治疗体系。

对于Prime editor这种接近2000个氨基酸的大型多结构域蛋白来说，这一问题更加突出。蛋白在翻译过程中高度依赖协同折叠与分子伴侣辅助，任何稳定性下降都可能导致错误折叠、核糖体停滞甚至聚集降解。因此，仅提升催化效率并不足够，提升整体蛋白质量同样关键。

与此同时，近年来AI驱动的蛋白质设计技术快速发展。诸如ProteinMPNN等深度学习模型已经被证明能够在保持蛋白功能的同时改善蛋白稳定性与折叠性质。因此，研究人员提出一个关键问题：能否利用AI重新设计已经经过实验室进化的RT，在不破坏催化功能的前提下恢复其稳定性与表达能力？

方法

研究人员首先分析了PE6、PEmax等Prime editor中的RT结构，发现经过实验室进化后的RT在细胞中的蛋白表达量明显低于野生型RT。随后，研究人员建立了一套AI辅助蛋白重设计流程。

该流程首先基于AlphaFold预测RT结构，并利用ProteinMPNN对允许变异的区域进行序列重设计。为了避免破坏催化功能，研究人员固定了靠近催化核心、底物结合位点以及进化高度保守的氨基酸，仅对外围区域进行设计。研究人员设置不同距离阈值和保守性阈值，共生成384个RT候选变体，并通过AlphaFold2进一步筛选其结构可信度和与原始结构的相似性。

随后，研究人员将筛选后的RT重新整合进Prime editor中，通过LNP-mRNA递送、细胞编辑实验、ClinVar致病突变修复筛选、原代细胞编辑、eVLP递送以及小鼠体内递送等方式系统评估其性能。

图1：实验室进化RT的表达下降与AI重设计流程。

结果

实验室进化后的RT存在明显稳定性缺陷

研究人员首先比较了不同Prime editor在细胞中的蛋白表达水平。结果发现，包含实验室进化RT的PE6a、PE6c和PE6d，其蛋白表达量显著低于野生型RT版本以及Cas9 nuclease。

特别是在mRNA-LNP递送条件下，进化RT版本的峰值蛋白水平下降约1.5–2倍。这说明虽然实验室进化提升了催化能力，但同时也降低了蛋白稳定性与表达能力。随后，研究人员使用ProteinMPNN对RT进行大规模重设计。AI模型在保留催化核心结构的同时，对外围区域进行了广泛替换，部分变体中甚至有超过40%的残基被重新设计。

AlphaFold2分析表明，这些新RT虽然序列差异巨大，但整体三维结构依然高度保守。

AI重设计RT显著提高Prime editing效率

研究人员随后在Hepa1-6细胞中测试这些AI重设计RT的编辑性能。

结果显示，在174个测试变体中，95%的RT仍保留Prime editing活性，而约30%的设计版本性能超过原始PE6或PEmax系统。

其中表现最佳的变体相比原系统编辑效率提升明显：

• PEmax提升最高约2.3倍
• PE6a提升约1.7倍
• PE6c提升约1.3倍
• PE6d提升约1.4倍

值得注意的是，这些提升是在原本已经具有较高编辑效率的基础上实现的，说明AI重设计确实改善了Prime editor整体性能，而不仅仅是恢复活性。

研究人员还发现，更严格保留进化保守位点的设计通常性能更好，说明保留天然进化中关键功能残基对于维持RT功能非常重要。

图2：PE8系列在细胞中的Prime editing效率提升。

PE8系统能够高效修复ClinVar致病突变

为了验证新RT是否具有广泛适用性，研究人员进一步构建了包含700种ClinVar致病突变的Prime editing筛选体系。

结果显示，多个AI重设计RT在大多数致病突变修复中均优于原始PE系统。

其中：

• PE8a平均编辑效率提升约2.1倍
• PE8c提升约1.4倍
• PE8d提升约1.4倍
• PE8max提升约1.2倍

在MSH6、LDLR、KCNJ2、TRIOBP等多种疾病相关基因中，新系统均实现更高修复效率。

研究人员最终将最佳变体命名为：

• PE8a
• PE8c
• PE8d
• PE8max

这些系统整体性能均超过此前广泛使用的PE6与PE7系统。

图3：ClinVar 700种致病突变修复筛选。

AI重设计显著提高RT表达量与热稳定性

研究人员进一步分析PE8性能提升背后的机制。

结果发现：

• PE8c蛋白表达量提升约2.3倍
• PE8d提升约2.0倍
• PE8max提升约2.1倍

与此同时，PE8c的熔解温度（Tm）相比PE6c提高约8°C，表明其热稳定性显著增强。

细胞外表达实验也显示，AI重设计RT具有更高可溶蛋白产量。这说明ProteinMPNN不仅改善了局部结构，还优化了整体蛋白折叠性质。

研究人员认为，这种稳定性提升是PE8编辑效率提高的重要原因之一。

图4：PE8系列RT的蛋白表达与热稳定性分析。

PE8在原代细胞、eVLP和小鼠体内均表现更强编辑能力

研究人员随后在多个更接近临床应用的体系中验证PE8性能。

在原代人类CD34+ HSPC中，PE8c针对HBB位点的编辑效率相比PE6c提升约1.6倍，并达到约50%的编辑效率。

在人T细胞中，PE8d在IL2RB位点也表现出更高编辑效率。

在eVLP递送体系中：

• PE8c在Dnmt1位点编辑效率达到78%
• 相比PE6c提升约1.6倍

在小鼠体内LNP递送实验中：

• PE8c编辑效率达到14%
• PE8d达到10%
• PE8max达到4.8%

相比原系统最高提升约2.9倍。

此外，研究人员还发现PE8并未增加indel副产物，也未明显增加脱靶编辑，说明其性能提升并未以牺牲编辑精度为代价。

图5：PE8在原代细胞与小鼠体内的治疗级编辑表现。

讨论

这项研究展示了一种非常重要的新范式：利用AI辅助蛋白重设计来“修复”实验室进化带来的稳定性代价。

过去，蛋白工程通常重点关注催化效率提升，但忽略了稳定性与表达能力。研究人员在本研究中证明，即使一个蛋白已经经过多轮实验室进化，仍然可以通过深度学习模型进一步优化其整体生物物理性质。更重要的是，这种策略不仅适用于Prime editing。研究人员提出，类似方法未来可能适用于更多复杂生物工程系统，包括碱基编辑器、重组酶、RNA编辑工具以及其他大型多结构域酶系统。

从更广泛角度来看，该研究也体现出AI在蛋白工程中的新角色：AI不再只是预测结构，而是能够直接参与“恢复”与“增强”实验室进化蛋白的可开发性。这意味着未来的蛋白工程可能会逐渐形成“实验室进化 + AI稳定化设计”的双轮驱动模式。对于基因治疗领域而言，PE8系列的出现进一步推动Prime editing向真实临床应用迈进。尤其是在LNP递送、原代细胞编辑以及体内治疗场景中，稳定性和表达能力往往才是真正决定疗效的关键因素。

整理 | DrugOne团队

参考资料

Tao, Y.A., Sakai, H.A., Jiang, A.Y. et al. AI-guided redesign of laboratory-evolved reverse transcriptases enhances prime editing. Nat Biotechnol (2026).

https://doi.org/10.1038/s41587-026-03149-6