为什么你的电转总是失败呢？

转染这个大学问少了“电穿孔”可不行～

Q1

质粒大小如何影响细胞存活率？

某些大质粒上所观察到的毒性效应与其长度并不相关，而更可能是由质粒所含序列，质粒制备过程引入的LPS一类污染物，电转极大量的质粒等因素所致。请保持使用基于阴离子交换层析的试剂盒（如我们的PureLink® HiPure试剂盒）来制备转染级的质粒DNA，同时避免柱体超载——否则可能会产生低纯度的质粒。

Q2

为何电转后的培养基中不含青霉素/链霉素一类的抗生素？

强电场的应用会削弱细胞膜结构，导致膜孔的形成，抗生素也会由此进入细胞内部。后续产生的毒性代谢中间产物很可能介导细胞死亡的发生。

此外，链霉素会与真核细胞核糖体相结合，进而直接干扰蛋白翻译过程。如果您的细胞需要培养于含抗生素的条件下，您可在电转操作数小时之后再加入抗生素。

Q3

我如何使用Neon™系统电转处理Neon™细胞数据库（Cell Database）当前尚未涵盖的细胞类型？

如果您在Neon™细胞数据库中找到一种与您所用细胞具有相同组织来源的类似细胞株时，您可借用这一细胞的参数。这并不保证您能够获得最佳结果，不过是一个好的尝试起点。举例来说，如果您拥有293T细胞，而又在Neon™细胞数据库中找到了HEK293细胞的转染方案，您就可将HEK293细胞的电转参数用于293T细胞，因为两者都源自人胚肾。

您可在Neon™设备中使用预先编程好的24孔优化方案来优化您的细胞转染条件。

Q4

每个Neon™转染管最多能够转染多少次？

Neon™转染管是一次性用品，我们推荐您最多使用每管转染10次（相同的质粒/siRNA/细胞类型），以最大限度地减少交叉污染的可能性。此外，我们强烈推荐您使用一个全新的Neon™管来转染不同类型的DNA/siRNA或细胞，以避免交叉污染。

如果您需要为实验匹配额外的Neon™管，可单独进行购买（目录编号 MPT100）。

Q5

如果尚无预先确定好的参数，我应采用何种电转参数转染siRNA？

一个比较好的尝试起点是同种细胞类型的质粒电转参数。Neon™细胞数据库为多种常用类型的细胞准备了优化的质粒转染方案。如果Neon™细胞数据库未包含目的细胞类型，您可使用Neon™设备中预先载入的24孔优化实验方案。

Q6

在质粒DNA上工作良好的仪器设置是否也能够良好适用于siRNA？

在大多数情况下，针对某一细胞系或原代细胞的质粒转染而进行优化的仪器设置也适用于siRNA。不过，这些设置参数并不一定是递送siRNA的最佳参数。因此，如需提升靶标的敲低效率，可能仍需要额外的优化操作。对于未经质粒DNA转染条件优化的细胞系或原代细胞，一组24孔优化实验可能是找到优化条件的最佳手段。请记得在每个测试条件中加入一个siRNA阴性转染对照，以便对敲低效率进行标准化计算。

Q7

我应如何为所用细胞系匹配电转参数？

Neon™细胞数据库包含多种常用细胞类型的优化转染方案。由于您所用细胞系的传代次数和/或培养条件，或分离步骤不会与我们所用的完全一致，因此您可基于特定细胞系对这些实验条件进行微调。数据库中的实验条件可作为您自身优化工作的起点。对于我们数据库中未列举的细胞系，Neon™设备中内置了预先编程的优化实验方案。

Q8

电转后最短多长时间才能够向培养基中添加抗生素？

电转完成后，请等待4-6小时再向细胞中加入抗生素。请确保细胞膜的完整性彻底恢复。

Q9

我该如何确定Neon™转染系统的细胞存活率和转染效率？

细胞存活率是指总细胞群体中确定具有活力的细胞数目。转染效率是指在所有存活细胞中成功表达您所构建载体的细胞数目（即，GFP阳性细胞）。

细胞活力也可通过碘化丙啶染色或台盼蓝拒染法来进行测定。对于贴壁细胞，可在染色前使用胰酶或TrypLE Express试剂进行细胞消化处理。用户可通过荧光显微镜选择适于检测GFP（发射波长：509 nm）的滤镜组来测定转染效率。可通过FACS或Countess®自动细胞计数仪来进行细胞计数。

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