一篇SCI来看蛋白DIA技术如何完胜DDA

要问目前最火的蛋白质组质谱检测技术是哪个，非DIA莫属。不同于传统的DDA技术（数据依赖采集模式），DIA（Data-independent Acquisition，数据非依赖采集）技术将质谱整个全扫描范围分为若干个窗口，高速、循环地对每个窗口中的所有离子进行选择、碎裂、检测，因此可以无遗漏地获得样本中所有离子的全部碎片信息，数据利用度大大提高，缺失值更少。

因此，DIA技术更适合于大样本量、复杂体系的蛋白检测。

与传统DDA技术相比，DIA技术具有以下优势：

（1）重复性大幅度提升：相比于DDA模式，DIA缺失值更少，不会有共流出效应，数据利用度和重复性大大提高；

（2）定量准确性更高：定量方式由通过一级质谱信号定量，升级为由每个肽段通过多个二级质谱峰面积信号进行定量。因此CV值较低，定量准确性更高；

（3）适合于大样本量：样本无需分馏分上机，极大缩短了每个样品的检测周期；另外由于重复性好，因此非常适合大样本量的蛋白研究。

说了这么多好话，有没有文章数据支持呢？

当然有哒！近几年来DIA的发表文章数目逐年增加，好技术不怕用数据和文章说话，下面我们就来看一篇2015年发表在《Journay of Proteome Research》（IF=4.268）的文章，该文章对87份腹痛小儿的尿液样本分别进行DIA检测和DDA检测，全方位比较DIA和DDA的鉴定结果，并利用DIA检测技术筛选疾病biomarker。

研究结果

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研究不同参考数据库对DIA蛋白鉴定的影响

DIA分析流程首先需要用DDA技术构建一个参考数据库。为了测试不同质谱数据库对DIA数据解析的影响，文章构建了5个不同的质谱数据库：

①从87份尿液样本中随机挑选23份样本，在Q Exactive质谱仪上进行DDA数据采集，共得到2077个蛋白；

②相同的23份尿液样本在Q TOF质谱仪上进行DDA数据采集，共1436个蛋白；

③所有87份尿液样本在Q Exactive质谱仪上进行DDA数据采集，与②的数据合并得到的共2575个蛋白；

④从网上下载的人类公共质谱数据库，共14158个蛋白；

⑤人类公共质谱数据库中与③重叠的1869个蛋白（图1）。

图1 不同的参考质谱数据库

然后分别利用这5个参考数据库对DIA数据结果进行蛋白鉴定，从鉴定的肽段、蛋白数目和鉴定重现性两方面来评估不同质谱数据库的蛋白鉴定效果。结果显示利用数据库③鉴定到最多的肽段和蛋白，分别为6061条肽段和1393个蛋白；然后是数据库①鉴定到5429条肽段和1191个蛋白；其他的数据库鉴定到的肽段都比较少（图2）。

重现性方面，通过比较三个技术重复样本间鉴定到的肽段和蛋白的百分比来进行比较。三个项目特异性质谱数据库（①②③）的肽段鉴定重现性为69%-77%，蛋白鉴定重现性为75%-81%，而人类公共质谱数据库④的肽段鉴定重现性和蛋白鉴定重现性仅为26%和22%，说明用人类所有组织类型样本的质谱数据库来鉴定尿液样本是不适当的，而应该用本项目的样本来构建参考数据库。

另外，文章也说明了不同的质谱仪构建的数据库对最终的鉴定结果影响很小。

Tips：

虽然目前也有可以不构建DDA数据库的方法，但我们还是建议在做DIA之前，用项目实验样本构建DDA参考数据库，对后面蛋白鉴定的准确性和数目还是非常有必要的。

图2 不同参考质谱数据库的蛋白鉴定结果。

深绿：在三个技术重复中都鉴定到的蛋白；绿色：在两个技术重复中鉴定到的蛋白；浅绿：只在一个技术重复中鉴定到的蛋白。

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DIA与DDA鉴定结果的比较

方法：对一个尿液样本进行DDA和DIA检测，分别各三次技术重复。

比较结果：

（1）肽段和蛋白的鉴定数目：DIA比DDA鉴定出多一倍的肽段和蛋白数目（蛋白数目DIA：1301，DDA：638），因此缺失值大大减少（图3）。

图3 DIA与DDA鉴定肽段和蛋白数目的比较

（2）定量精确度（CV值）：DIA的肽段和蛋白定量CV中值分别为6.7%和8.1%，DDA的肽段和蛋白定量CV中值分别为15.7%和16.3%，是DIA的CV值的两倍（图4）。因此，由于定量精确，DIA可以不做技术重复。

图4 DIA与DDA鉴定蛋白CV值的比较

总结：DIA无论在蛋白鉴定数目、重复性还是定量精确度，都完胜DDA。

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利用DIA方法鉴定生物标记物

在本文的87例腹痛小儿病患者中，12例诊断为卵巢囊肿，11例诊断为尿路感染（UTI），其余64例为诊断为其他原因或无法诊断病因，作为实验的对照组。

DIA检测鉴定结果：

平均每个样本鉴定出5714条肽段和1301个蛋白（图5 A,B）；在所有样本中总共鉴定出17303条肽段和2456个蛋白，占了参考质谱数据库③中蛋白数目的95%。

比较DIA模式和DDA模式在样本中检出蛋白数目的百分比，DIA模式能够在95%以上的样本中鉴定出490个蛋白，在少于10%的样本中鉴定出406个蛋白；而DDA模式在95%以上的样本中仅能鉴定出130个蛋白，而在少于10%的样本中鉴定出838个蛋白（图5 C）。说明DIA的重复性要远远优于DDA。

图5 DIA鉴定肽段与蛋白数目的统计（A,B）；鉴定蛋白在样本中的覆盖度（C）

生物标记物的筛选

卵巢囊肿：半胱氨酸蛋白酶抑制剂B（CYTB）能够将卵巢囊肿样本与其他样本显著地分开，其表达水平上升了5.8倍（p=1.3e-5, q=0.027），ROC曲线下面积为0.91（图6 A），说明CYTB可以作为腹痛病人诊断为卵巢囊肿的生物标记物。

UTI：髓过氧化物酶（PERM）是所有差异表达蛋白中最能够把UTI样本与其他样本显著地分开的蛋白，其表达水平上升了97倍（p=1.1e-6, q=2.8e-3），ROC曲线下面积为0.968（图6 B），说明PERM可以作为腹痛病人诊断为尿路感染的生物标记物。

图6 生物标记物的筛选

总 结

通过DIA和DDA的比较，我们可以总结出DIA在鉴定蛋白数目、重复性、定量准确性等方面都优于DDA，数据利用度大大提高，因此非常适合应用于生物标记物的筛选。

与传统的生物标记物发现方法相比，由于DIA在几百个样本中鉴定蛋白的重复性非常高，因此DIA可以将生物标记物的发现阶段（discovery）与验证阶段（verification）结合起来，不再需要另外独立的大量样本进行验证，并提高了生物标记物的检出效率。

Tips:

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参考文献：

Muntel J, Xuan Y, Berger S T, et al. AdvancingUrinary Protein Biomarker Discovery by Data-independent Acquisition on a Quadrupole-OrbitrapMass Spectrometer.[J].Journal of Proteome Research, 2015, 14(11):4752-62.