Nature Protocols：从人类胎盘建立可长期培养滋养层类器官（下）

文章介绍

2020年9月，来自英国剑桥大学的学者们在期刊Nature Protocols（IF:14.8000）发表了一篇题为“Establishment and differentiation of long-term trophoblast organoid cultures from the human placenta”的文献。

它介绍了从人类胎盘建立和分化长期滋养层类器官培养物的过程这项开创性的研究建立了一个体外模型系统，该系统可近似模拟人类胎盘的独特特征，使人们能够更好地了解妊娠疾病。

上期回顾请点击：【Nature Protocols】系列：从人类胎盘建立可长期培养的滋养层类器官（上）

今天小学社将为大家详细讲解本研究中实验操作的52项具体步骤。

实验步骤

胎盘组织的酶消化 ● 时间 1.5-2 小时

1、在室温（RT，21-24 °C）下将胎盘样本转移到洗涤培养基中，并在一小时内进行处理。我们没有发现需要最少的组织量。我们使用的每个胎盘样本在大小和形态上都不尽相同。类器官的成功衍生与初始组织的大小并无关联。

2、在水浴中将 0.2%胰蛋白酶-250/0.02%EDTA/PBS 预热至 37°C。

3、将胎盘组织放入洗涤培养基中，在磁力搅拌器上于 RT 温度下轻轻搅拌 >10 分钟，以去除污染的胎盘组织。

4、将胎盘样本倒入培养皿中的洗涤培养基中，用镊子将组织转移到干净的培养皿中（图 2b）。

图 2b

5、用镊子去除可见的血凝块，注意不要损伤绒毛（图 2c）。

图 2c

6、按住胎盘的一端，用手术刀刮除绒毛膜上的绒毛。丢弃剩余的胎膜（图 2d，e）。

图2d

图2e

7、将刮下的绒毛转移到 75 mL 预热的 0.2% 胰蛋白酶-250/0.02%乙二胺四乙酸瓶中，瓶子上有一个磁力搅拌棒（图 2f）。密封瓶盖，放在 37 °C 的加热磁力搅拌器上轻轻搅拌消化 3-5 分钟。

图2f

8、用放在漏斗中的无菌纱布过滤分解的细胞悬液，并立即用消化停止液（补充 20% FBS 的洗涤培养基）洗涤，以阻止胰蛋白酶消化。(保留带有部分消化残余物的纱布）（图 2g）。

图2g

9、在 RT 条件下以 400g 离心 5 分钟，使滤液沉淀，并将细胞沉淀重悬于洗涤培养基中。直到步骤 12（这是 "组织消化 1"）。

10、从纱布上取下未消化的组织，用 12 mL 胶原酶 V 溶液进一步消化1.0 mg/mL 在 Hams F12/10% FBS 中的胶原酶 V 溶液，装入带磁力搅拌棒的瓶中。密封瓶盖并将其置于37 °C 下轻轻搅拌 3-5 分钟（图 2g）。

11、按步骤 8 所述过滤得到的细胞悬浮液，然后按步骤 9 所述离心沉淀细胞（这是 "组织消化液 2"）。

12、将步骤 9（组织消化液 1）和步骤 11（组织消化液 2）中得到的细胞混合，并用Advanced DMEM/F12 培养基中洗涤。

滋养层类器官培养物的启动和建立 ● 时间 2-3 周

13、将步骤 12 中的沉淀重悬于 1 mL Advanced DMEM/F12 培养基中，转移至 1.5 mL离心 6 分钟。

14、移去上清液并估算颗粒体积。轻弹试管，使颗粒松动。并置于冰上 2-3 分钟。加入 10× 体积：体积的冰冷 Matrigel，用移液管轻轻搅拌混合。立即将试管放回冰上。

15、在康宁 48 孔组织培养板的每个孔中央滴入 25-μL Matrigel/细胞悬浮液（图 2h）。放入培养箱中静置至少 15 分钟。

图2h

16、用 250 μL TOM 覆盖每一滴培养液。

17、将培养物置于 5%CO2、37 °C 的加湿培养箱中。

18、每 2-3 天更换一次培养基。

19、检查培养物是否出现小而密集的类器官团。通常在7-10天可见，(图 2i, j)。

图2i，j

图2 滋养层类器官的衍生。从妊娠早期胎盘细胞分离到滋养层类器官形成的衍生过程概述。a，滋养层类器官培养物建立过程的时间线。b-g，图像显示在140 mm培养皿中从胎盘组织中分离细胞的过程，b，c，清洗胎盘并去除血块，d，e，用手术刀刮绒毛去除细胞，f，收集在e图框中看到的细胞并用0.25%胰蛋白酶/EDTA消化。g，酶消化后，悬浮液通过纱布过滤。收集残留在纱布上的组织用胶原酶V进行第二次消化。 h，两种消化物结合在基质中重悬，并在48孔板中滴成25μL液滴。6天后可见细胞团。i，到第11天（p0），在残留的组织碎片中可以清晰地看到滋养层类器官。j，传代后（p1，第6天），存在一个均匀的滋养层类器官群体。

滋养层类器官培养物的维持和传代 ● 时间 1.5 小时

20、定期监测类器官的外观，当至少 50%的类器官直径达到 200-300 μm 时（通常在衍生后的步骤 19 后的 7-10 d 或已建立的培养物的步骤 32 之间），进行以下步骤传代培养（图 3b、c）。

图3b，c

21、在不移除培养基的情况下，用 1 mL移液管吸头在每个孔的生长面上前后刮动将培养基和脱落的 Matrigel 液滴一起吸出，然后将培养孔中的内容物转移到1.5 mL的 EP管，每管最多四个孔。

22、向孔中再加入约 300 μL 的洗涤培养基，以收集剩余的类器官。将其加入EP管中。

23、在 RT 条件下以 600g 离心 6 分钟，使其沉淀。移去上清液，在每个试管中加入 约150 μL Advanced DMEM/F12。

24、使用小口径移液器吸头将类器官和 Matrigel 打碎。我们建议使用具有 "混合 "功能的电子移液器，并将其吸取量设置为 150 μL。

25、加入 1 mL Advanced DMEM/F12，在 600g 转速下离心 6 分钟。去除上清液。加入500 μL 预热（37 °C）的 Stem Pro Accutase 并置于 37 °C的加湿培养箱中 5-6 分钟。

26、加入 1 mL Advanced DMEM/F12，在 600g 转速下离心 6 分钟。去除上清液。加入150 μL 高级 DMEM/F12，用中等力度手动上下移液约 80 次。

27、加入 1 mL Advanced DMEM/F12，在 600g 转速下离心 6 分钟。去除上清液。在此阶段，沉淀中应很少含有 Matrigel。

28、轻弹试管，重新悬浮颗粒。将试管放在冰上。

29、每次取一个试管，加入冰冷的 Matrigel，轻轻混匀，然后将试管放在冰上。允许每孔 25 μL Matrigel 的估计体积。将类器官集中在一起，轻轻混合，使其均匀分布在 Matrigel 中。以最佳方式生长的类器官可每 7-10 d 以 1:2 的比例传代。

30、将 25-μL 的液滴小心滴入 48 孔培养板的生长区中心，注意不要产生气泡（图 3c）。移取液滴时将试管放在冰上。

31、将培养板放入培养箱中至少 15 分钟，使 Matrigel 固化。

32、每孔加入 250 μL TOM，继续培养类器官。7-10 d 后，扩大培养物进行实验（重复步骤 20-32），或进入下一阶段分化类器官，从而生成 EVT（步骤 33-38），或进入单细胞分离程序(步骤 39A 分离细胞用于单细胞分析或准备克隆扩增）。

图3 问题解决：识别腺体污染和传代滋养层类器官培养物的时间。a，不同程度的腺体污染图像。有一个小球体(紫色圆圈)的腺体污染(左)。在更高倍的放大倍数下形成一个具有中央腔的球状体（中间）。严重的腺体污染已经占据了培养物（右）。只有少数滋养层类器官可见（白色圆圈）。b，由于大小（左）或密度（右）的大小，可以进行传代的滋养层类器官。c，6天内最佳滋养层类器官扩张。d，类器官传代后的各种结果的例子。经过适当传代的培养物（左图）有许多小块细胞。偶尔可能会出现较大的类器官。当类器官没有被正确分解（中间），更少的团块存在，大多数团块很大。如果类器官传代过于用力（右），那么传代后只留下碎片。e，由于过度生长和未能破坏大型类器官（左）或密度过低（右）而死亡的类器官的例子。比例尺，1mm。

从滋养层细胞类器官生成 EVT ● 时间 1-3 周

33、按步骤 20-32 所述方法传代类器官，但要修改步骤 30，以便将多个Matrigel 滴（10 μL）到 ibidi μ皿中（图 4b）。

图4b

34、在 TOM 中培养 3-4 d。

35、将培养基替换为 EVT 培养基 #1 。培养数天，每 2-3 天补充一次培养基。

36、当类器官开始长出新芽时（通常在培养 8-14 d 后），用 EVT 培养基 #2 替换培养基。

37、继续在 EVT 2 号培养基中培养 3-7 d（即通过后共 11-21 d）或直至产生足够数量的粘附 EVT。

38、用 HLA-G 偶联抗体进行活细胞染色，评估 EVT 的分化情况。或按照以下单细胞分离方案用流式细胞仪分析细胞(步骤 39B，然后步骤 40-52）。

图4 EVT的分化和表征。a，显示EVT分化过程中培养基的不同变化的时间线。b，EVT分化过程中基质凝胶液滴的图像。从左到右，代表EVT分化开始的图像（第0天），NRG1从培养中移除是大多数类器官生长（第8天），以及EVT分化完成（第12天）。比例尺，500 μm。c，流式细胞术培养EVT分化终点（n=3）。W6/32（所有HLAI类分子）和MEMG-9（HLA-G）共染色表明，存在完全分化的EVT细胞（W6/32+，MEMG-9+），一些正在转变的滋养层（W6/32+，MEMG-9-），还有一些仍未分化（W6/32-，MEMG-9-）。象限是基于同型控制来绘制的。d，一种针对HLA-C的特异性抗体（DT9）表明，这些分化的细胞在体内也上调HLA-C（n=3）。同型控制显示为填充的粉红色直方图。

单细胞隔离 ● 时间 3 小时

39、如果从步骤 32 开始使用类器官，继续选择A。如果你从上一步的类器官开始，继续选择B。

步骤A

从绒毛滋养层类器官中分离单细胞（步骤 32） ● 时间 1.2 小时

(i) 在不去除培养基的情况下，用 1 mL移液管吸头在每个孔的生长面上前后刮动

将 Matrigel 滴分离到培养基中。将孔中的内容物转移到 1.5 mL的 EP管中，每管三或四个孔。

(ii) 在 600g 转速下离心 6 分钟。去掉上清液，将沉淀重悬于 1 mL 细胞回收液中。将试管水平放在冰上，以避免类器官颗粒。在冰上放置 1 小时。

步骤B

从滋养层外滋养细胞器质中分离单细胞（步骤 37） ● 时间 1.2 小时

(i) 去除培养皿中的培养基。用 PBS 冲洗培养皿。

(ii) 直接向培养皿中加入 1.5 mL 细胞复苏液。将整个培养皿放在冰上确保所有 Matrigel 液滴都浸没在溶液中。在冰上保持1 小时。

(iii) 收集溶液并转移到 1.5 毫升的EP 管中。用移液管上下用溶液冲洗培养皿。这将使仍粘附在培养皿底部的细胞脱落。如果仍有许多细胞附着在培养皿上，则在分配溶液时轻轻刮擦培养皿，以去除细胞。

40、转速 600g 离心 6 分钟，使其沉淀。去掉上清液，用冰冷的 PBS 冲洗沉淀。

41、在 RT 条件下以 600g 离心 6 分钟，使其沉淀。去掉上清液，加入 200 μL 洗涤培养基进行单细胞分离。用小口径移液器吸头上下移动约 400 次，使类器官破裂。在此步骤中，我们建议使用具有 "混合 "功能的电子移液器，并将其吸入量设置为 150 μL。

42、加入 1 mL  Advanced  DMEM/F12，在 600g 转速下离心 6 分钟。去除上清液。

43、加入 500 μL 预热（37 °C）的 Stem Pro Accutase 并转移到四孔板中。放入5 分钟。

44、将细胞悬浮液转移到 5 毫升聚丙烯试管中，并加入 1 ml洗涤培养基。在 RT 条件下以 600g 离心 6 分钟，使其沉淀。

45、除去上清液，重悬于预热（37 °C）的 500 μL 0.5 mg/mL 胶原酶 V溶液中。将细胞悬浮液转移到四孔培养皿中，放入 37 °C 加湿培养箱中培养 15 分钟。培养中途打乱/摇晃悬浮液。

46、将细胞悬浮液转移到同一5mL聚丙烯试管中，用2 mL洗涤培养基稀释悬浮液。让细胞沉淀 1 分钟（大块的细胞会沉淀下来），然后取出顶部 2mL溶液，然后用带细胞过滤器扣盖的Falcon试管过滤（通过过滤器的细胞对应于 “类器官消化液 1”）

47、将含有大块细胞的剩余溶液重悬于预热（37 °C）的 500 μL 0.5 m/mL 胶原酶 V 溶液中重新悬浮含有大块细胞的剩余溶液，然后放入培养箱中再培养 15 分钟（开始收集“类器官消化液 2”的过程）。

48、将步骤 46（类器官消化液 1）中得到的细胞以 600g 离心 6 分钟，使其沉淀（上清液可弃掉），然后重悬于洗涤培养基中。

49、收集步骤 47 中得到的细胞（在“类器官消化 2”），用洗涤培养基稀释，然后用带细胞滤器的 Falcon 试管过滤。

50、将步骤 49 中通过过滤器的细胞在 600g 转速下离心 6 分钟，使细胞沉淀。(弃去上清液），并重新悬浮于洗涤培养基（类器官消化液 2）中。

51、将步骤 48（类器官消化液 1）和步骤 50（类器官消化液 2）的细胞悬浮液合并到一个试管中。将合并的悬浮液在 600g 转速下离心 6 分钟，然后重悬于总共 1 mL 的洗涤培养基中，测定悬浮液中的细胞总数。

下游检测

52、现在，单细胞悬液可用于流式细胞仪（选项 A）或克隆扩增。(选项 B；注意该选项不适用于按步骤 33-37 所述方法分化的类器官）。

选项A

(A)流式细胞术 ● 时间 1-2 小时

(i) 用冰冷的 FACS 缓冲液清洗细胞，然后在 RT 条件下以 400g 离心 5 分钟，使细胞沉淀。

(ii) 去除上清液，用 FACS 缓冲液重悬。用人 IgG（每 1 × 106 个细胞含 5 μg IgG）阻断 15 分钟。

(iii) 将细胞悬浮液等分到 FACS 管中，并与适当的抗体混合。使用的偶练抗体是 HLA-ABC-488（克隆 W6/32，1:50 稀释）和 HLA-G-PE（克隆 MEMG-9，1:100 稀释）和非结合一抗 HLA-C(克隆 DT9，1:100 稀释）。将悬浮液在冰上孵育 30 分钟。

(iv) 加入 2 mL FACS 缓冲液清洗，并在 RT 下以 400g 离心 5 分钟，使其沉淀。

(v) 对于含有偶练抗体的试管，去除上清液，重悬于 100 μLFACS 缓冲液和 100 μL 4%（体积分数）多聚甲醛中重悬。室温下静置15 分钟。这些试管即可进行分析。

(vi) 对于含有未偶联抗体的试管，移去上清液，重悬于 FACS 缓冲液中，加入二抗（488 羊抗小鼠 IgG，1:100 稀释）。在冰上静置 30 分钟。

(vii) 加入 2 mL FACS 缓冲液，用第二抗体清洗试管，然后在室温下以 400g 离心 5 分钟。

(viii) 去除上清液，用 100 μL FACS 缓冲液和 100 μL 4%（体积分数）多聚甲醛重悬。室温下静置 15 分钟。这些试管即可进行分析。

选项B

(B)克隆扩增 ● 时间 1-2 个月

(i) 使用血细胞计数器和台盼蓝测定单细胞分离活细胞的浓度，然后将剩余的细胞在 600g 离心 6 分钟并在 RT 条件下沉淀。

(i) 用血细胞计数器和胰岛素蓝测定单细胞分离活细胞的浓度，然后将剩余的细胞在 600g 转速下离心 6 分钟。

(ii) 以 0.5 cells/5 μL 的浓度将细胞重悬于冰冷的 Matrigel 中。

(iii) 在 96 孔培养皿中滴加 5μL 细胞/Matrigel 悬浮液（每孔一滴）。

(iv) 将培养皿放入培养箱中至少 15 分钟，使 Matrigel 固化。

(v) 每孔加入 100 μL TOM。

(vi) 每周更换培养基。1-2 周内应能看到小的类器官（图 6b）。

(vii) 当一个类器官长到足够大时（通常是在培养 2-4 周后），手动通过用小口径移液器吸头在培养孔中上下移动类器官 100 次（图 6c）。

(viii) 将悬浮液转移到 0.5 mL Eppendorf 离心管中，在RT 下 600g 离心 6 分钟，使其沉淀。

(ix) 去除上清液，重悬于 25 μL 冰冷 Matrigel 中。滴入48 孔板的一个孔中。

(x) 放入培养箱至少 15 分钟。加入 250 μL TOM。

(xi) 按步骤 20-32 所述培养克隆衍生的器官组织（图 6d）。

(xii) 一旦克隆建立并生长良好，在 TOM 中繁殖以研究滋养层细胞类型、VCT 和 SCT（如步骤 20-32 所述），或分化为 EVT（如步骤 33-38 所述）。

图5 流式细胞仪分析的控制和门控策略。a，流式细胞术检测对照细胞系，JAR和JEG-3，分别作为HLA I类的阴性和阳性对照，以及向EVT分化的滋养层类器官。W6/32（所有HLA I类分子）和MEMG-9（HLA-G）共染色表明，存在完全分化的EVT细胞（W6/32+，MEMG-9+），一些正在转变的滋养层（W6/32+，MEMG-9-），还有一些仍未分化（W6/32-，MEMG-9-）。象限是基于同型控制来绘制的。b，一种HLA-C特异性抗体（DT9）表明，向EVT细胞分化的类器官也上调HLA-C. c，用于流式细胞仪分析单个活细胞的门控策略。

图6 滋养层类器官的克隆分离、繁殖和分化。a，克隆基因分析的细节和克隆分离的预期时间线。b，图像显示约培养2周后出现一个小细胞团（黑色箭头突出显示）。c，两个不同的分离克隆的代表性图像。一旦克隆达到了右边图像的大小，它就应该被传代。d，一个克隆被适当扩展导致许多滋养层类器官的例子。e，一个克隆衍生的滋养层类器官的电子显微镜图像。Mamrigel(M)区域，以及类器官分泌自身的细胞外基质（L，腔）的内部区域。细胞核用紫色箭头（左）或N（右）表示。存在多核区域（左，紫色箭头突出显示一个细胞边界内的细胞核）和表面微绒毛（右），也显示在管腔区域(L)。f，从一个分离的克隆中产生的滋养层类器官的h&e染色切片。类器官中心的多个中空区域是SCT产生的陷隙。g，经EPCAM、F-actin和DAPI染色的克隆衍生的滋养层类器官的共聚焦显微镜图像。h，从EVTM中克隆培养的滋养层类器官入侵3D，用HLA-G单克隆抗体G233（FITC，绿色）染色，以确认分化。i，这里的活细胞通过基质凝胶迁移并粘附在塑料培养皿上。当细胞入侵时，通过基质胶的轨迹是相位的。比例尺为500μm（b−d）；10 μm (e)；150 μm (f)；100μm（g−i）。

故障排除表

参考信息

Generation and characterization of hair-bearing skin organoids from human pluripotent stem cells.Nat Protoc. 2022 May;17(5):1266-1305. doi: 10.1038/s41596-022-00681-y.PMID: 35322210 PMCID: PMC10461778.

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