生物物理技术检测人血清白蛋白(HSA)分子互作

HSA 是一种单体多结构域大分子，其非糖基化的单链多肽包含585个氨基酸，分子量约为66kD。HSA 主要由3个结构相似的结构域Ⅰ (1–195 aa)、结构域Ⅱ (196–383 aa) 和结构域Ⅲ (384–585 aa) 组成：(见图1)。并且每个结构域均包含2个亚结构域 (A和B)，并且各子结构域分别由4和6个α-螺旋构成。

HSA 还具有多个配体结合位点，可通过共价、非共价结合或融合表达将药物搭载到白蛋白上。HSA 中已被证明含有的两个主要药物结合位点(Sudlow位点Ⅰ和Sudlow位点Ⅱ)，分别位于子结构域 ⅡA和ⅢA (见下图1)，HSA 的构象变化受外部环境 pH 值变化的调节，影响其运输特性 [1]。

图1.HSA 的结构和相关的结合位点

SPR在PD-L1单域抗体探针发现中的应用：

检测抗体与白蛋白结合亲和力

程序性细胞死亡蛋白 -1(PD-1) /程序性死亡受体配 1(PD-L1) 是癌细胞逃避免疫的关键。针对 PD-1/PD-L1 的抗体疗法已在多种肿瘤中显示出显著疗效。免疫正电子发射断层扫描(ImmunoPET)成像技术可能有助于重塑实体瘤的免疫疗法格局 [2]。

研究人员通过与 Fc 融合的人 PD-L1 细胞外结构域免疫新疆双峰驼、构建 DNA 文库、噬菌体展示技术获得阳性克隆、再进行二代测序及蛋白重组表达等分子生物学手段，制备了 PD-L1 特异性单价单域抗体RW102及其 ABD衍生物 ABDRW102 (图2A和2B)；二者与人重组 PD-L1 的结合能力极强，其KD值分别为15.29 pM和3.71 pM，并且在 ABDRW102 抗体中引入 ABD035 序列后，ABDRW102 与人 PD-L1 的亲和力提高了四倍 (图2C和2D)。

ABDRW102与人血清白蛋白(human serum albumin ，HSA)和鼠血清白蛋白 (murine serum albumin，MSA) 也具有很高的亲和力 (图2 E和2F)。此外，该结果证明：其 KD 值分别为 3.38 pM 和 52.74 pM。获得了亲和力达到皮摩水平的超高亲和力结合蛋白。后面，研究人员通过设计成像探针，单域抗体的 PD-L1 免疫PET探针，包括 [68Ga]Ga-NOTA-RW102、[68Ga]Ga-NOTA-ABDRW102、[64Cu]Cu-NOTA-ABDRW102和[89Zr]Zr-DFO-ABDRW102，初步临床前和临床证据表明，使用 [68Ga] Ga-NOTA-RW102 进行免疫 PET 成像有望观察到不同的 PD-L1 表达，为 PD-L1 靶向治疗选择患者，并监测与免疫相关的不良反应 [2]。

图2.(A, B) RW102和ABDRW102的SDS-PAGE检测；

(C, D) RW102和ABDRW102与人PD-L1蛋白的SPR亲和力测定；

(E, F) ABDRW102与HSA和MSA的SPR亲和力测定结果

SPR助力长效化GLP-1RA设计与筛选：

多肽与HSA结合亲和力测定

目前，由于多肽类药物在体内的作用时间较短，其治疗效果往往受到限制。研究人员利用由柔性连接体 (GGGGS)2 和凝血酶 (TBN) 可切除位点 (FNPR) 组成的中间序列，将一系列具有不同长度脂肪链的七肽标签与突变的胰高血糖素样肽 -1(GLP-1) 的 N 端融合，开发出了有望延长 GLP-1 受体 (GLP-1R) 激动剂作用时间的药物。并命名为 PESO1-PES21 (如图3) [3]。

图3.七肽融合GLP-1设计示意图

表1.融合肽与HSA的亲和力/动力学筛选

随后，研究人员采用SPR 技术进行了融合肽与HSA的亲和力筛选，从结果中可以看到 (表1)，在21种融合肽中， PES13 、 PES14 和 PES15 与 HSA 的结合能力相近，并且具有较高的亲和力。PES13， PES14 ，和 PES15 与HSA的亲和力分别为383 nM，696 nM 和 512 nM。同时，实验结果证明， PES13 ， PES14 ，和 PES15 与 HAS 亲和力较强的原因在于与 HSA 结合解离过程中，解离速率比较慢，说明其与 HSA 的结合稳定性较强，这位多肽的长效化设计奠定了基础。后续针对这三例药物，研究人员进行了相关的血浆稳定性实验及动物实验，确定了基于此设计的 PES14 在保证药物有效性的同时，较好的提升了药物的半衰期。

ITC技术助力白蛋白(HSA)受体药物的递送：

LNPs与白蛋白(HSA)的亲和力测定

脂质纳米粒子(LNPs)具有作为 mRNA 的递送具备非常大的潜力。然而，重复给药 LNPs 可能会导致递送材料的积累和相关毒性。研究人员部分可生物降解的脂质纳米制剂，它能提高 LNPs 的清除率并降低毒性，将具有良好细胞摄取率的脂质与具有良好逃逸能力及系统耐受性的生物可降解炔烃脂质结合，且加入炔脂脂质可明显增加膜融合以促进 mRNA 的释放，从而协同改善 mRNA 的递送 [4]。

图4.法检测LNPs与白蛋白(HSA)的亲和力

载脂蛋白(ApoE)是 A6 LNPs 蛋白冠的主要成分，研究人员为了研究白蛋白 (HSA)  和 LNPs 间的相互作用，作者用等温滴定量热法 (ITC) 测定了白蛋白与 LNPs 的亲和力(图4)。虽然， cKKE12 LNPs 和 A6 LNPs 分别与人白蛋白(HSA)的相互作用相对较弱，cKK-E12 LNPs (Kd：5.7 μM) 与的 HSA的亲和力比 A6 LNPs (Kd：24.4 μM) 高出近5 倍，而 HSA 与 CKK-E12 LNPs 热力学焓变(926 kcal/mol)是 A6 LNPs (489 kcal/mol) 的 2 倍 [4]。

作者开发出了一种部分可生物降解的协同 LNPs，它具有强大的 mRNA 递送功效，并提高了单次和重复注射的耐受性。细胞摄取和内吞体逃逸是影响 mRNA 递送效率的两个关键过程，作者开发了一种由炔烃脂质和cKK-E12脂质混合制得的 LNPs。cKK-E12 使其能够通过白蛋白介导的内吞途径被细胞大量摄取，炔烃脂质能够提高其内体逃逸能力从而增加蛋白表达水平，此外，可生物降解的炔烃脂质也能改善其耐受性从而增强疗效。从疗效与安全性来看，包载基因的协同 LNPs 有望用作蛋白质替代疗法。

MST及BLI在抗原抗体表位计算设计中的应用：

检测抗体与蛋白结合亲和力

作者针对三种不同的抗原设计了六种单域抗体，探索了两种嫁接策略：将设计的 CDR 直接嫁接到稳定的支架上，以及将设计的 CDR 与结构上与之兼容的支架相匹配。第一种策略提供了测试从头开始 CDR 设计程序的机会，最大限度地减少了嫁接可能引起的并发症。第二种方法则更为复杂，可以将多个 CDR 环设计到结构上与表位相匹配的支架上。两种设计的单域抗体 (DesAbs) 针对的是新型冠状病毒 (SARSCoV2) S蛋白受体结合域(RBD) 、三种人血清白蛋白(HSA) 和一种胰牛胰蛋白酶 (表2) 。初步验证选择了 HSA 和胰蛋白酶。这两种蛋白都是现成的，而治疗蛋白与 HSA 的结合是决定药代动力学的关键因素。此外，胰蛋白酶提供了可以在难以接近的凹陷表位上测试设计策略的机会，该表位上有一个活性位点。SARS-CoV-2 的 RBD 充分体现了靶向特定表位的重要性，因为与 ACE2 受体结合位点重叠或接近 ACE2 受体结合位点的区域结合，同时避开糖基化位点，会产生中和抗体候选物。而候选抗体，这将从立体上阻碍病毒与人类细胞受体的结合 [5]。

表2. 研究中使用的DesAbs

图5.HSA与DesAbs亲和力实验[5]

研究人员采用了MST技术检测 DesAb-HSA-P1、DesAb-HSA-P2、DesAb-HSA-D3与HSA的亲和力，其中采用荧光标记 DesAbs (70 nM)，不同浓度的 HSA 进行检测。发现其亲和力范围为140至810 nM (图5A-E)，为了验证实验结果，进一步使用固定化 HSA 进行生物层干涉法(BLI)实验，获得了与MST的结果一致 (图5D和5E)。在MST实验中，作为阴性对照使用的胰蛋白酶靶向 DesAb Tryp 在该测定中未检测到与 HSA 的结合信号 (图5D)。在胰蛋白酶实验中 DesAb-Tryp 能够结合其预期的胰蛋白酶，而 DesAb-HSA-P1 和 DesAb-HSA-P2 没有显示结合信号，并且在结合检测过程中，可能被胰蛋白酶消化。

作者通过BLI竞争实验分析得出，DesAb-HSA-P1 和 DesAb-HSA-D3 相互竞争与 HSA 的结合，因为其中一种的结合受到另一种抗原结合的 DesAb 的阻碍。相反，DesAb-HSA-P2 不与二者竞争，因为其结合不受其他抗原结合 DesAb 存在或不存在的影响(图5F)。这种竞争行为完全符合设计理念，因为 DesAb-HAS-D3 和  DesAb-HSA-P1 被设计为针对部分重叠的表位，而 DesAb-HSA-P2 则针对抗原另一侧的不同表位。

图6.RDB DesAbs结合亲和力实验

与 HSA 靶向 DesAbs 一样，针对 S 蛋白的 RBD 结构域的两种设计也显示出了纳摩尔级的亲和力。首先作者使用MST测试了三种待测物 DesAb­RBD­C1、 DesAb­RBD­C2 和 DesAb­HAS-P2 分别与 Alexa Fluor 647–labeled 标记的完整的三聚体 S 蛋白在溶液中的结合情况 (图6B和6C)。其中 DesAb­RBD­C1、DesAb­RBD­C2 均显示与三聚体 S 蛋白结合，而用作阴性对照的 HSA 靶向 DesAb-HSA-P2 在测定中没有信号(图6C)。这证实了观察到的结合来自于设计的 CDR3 motif。DesAb­RBD­C1 和 DesAb­RBD­C2 与三聚体 S 蛋白的Kd值分别为150 nM 和580 nM。为了进一步确认实验结果，作者用固定化的天然糖基化 RBD 进行了生物膜干涉技术(Bio-Layer Interferometry，简称BLI)测定，其 DesAb-RBD-C1 和 DesAb-RBD-C2 与糖基化 RBD (S 蛋白) 的Kd值分别为210和130 nM (图6D和6E)。

作者描述了一种基于片段的策略，用于合理设计针对结构表位的抗体。使用至少四个残基(通常更长)的蛋白质片段，以组合方式组装设计 CDR。实验结果表明，作者提出的设计方法可以产生高度耐热的单结构域抗体，并在两种独立的生物实验技术(MST和BLI)中得到证实，该方法设计出的抗体与抗原结合Kd值纳米摩尔范围内。这为新冠病毒中和抗体的结构特征研究提供了一定参考，为设计及优化得到特异性高、疗效好、安全性强的新冠病毒中和抗体奠定了基础。

参考文献

[1] Wasko, J., et al. "Studies on Interactions of Human Serum Albumin with Hot Spots and Peptidic Inhibitors of Insulin and Amylin Aggregation." (2022).

[2] Zhang, You, et al. "Preclinical development of novel PD-L1 tracers and first-in-human study of [68Ga] Ga-NOTA-RW102 in patients with lung cancers." Journal for Immunotherapy of Cancer 12.4 (2024).

[3] Niu, **anli, et al. "Design and evaluation of novel thrombin-based GLP-1 analogs with peptidic albumin binding domain for the controlled release of GLP-1." RSC advances 10.8 (2020): 4725-4732.

[4] Miao, Lei, et al. "Synergistic lipid compositions for albumin receptor mediated delivery of mRNA to the liver." Nature communications 11.1 (2020): 2424.

[5] Aguilar Rangel, Mauricio, et al. "Fragment-based computational design of antibodies targeting structured epitopes." Science Advances 8.45 (2022): eabp9540.

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